葛根素抑制人成骨樣MG-63細(xì)胞分泌IL-6的分子機(jī)制研究

羅 婷，李樂(lè)飛，郭小芹，張立朋，王 越，李 玲，韓澤民

（1．遼寧醫(yī)學(xué)院武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧錦州 121000；2．武警后勤學(xué)院病原生物和免疫學(xué)教研室，天津 300309；3．武警后勤學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津 300309；4．武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院口腔教研室，天津 300162）

葛根素抑制人成骨樣MG-63細(xì)胞分泌IL-6的分子機(jī)制研究

羅 婷1，李樂(lè)飛1，郭小芹2，張立朋2，王 越2，李 玲3，韓澤民4

（1．遼寧醫(yī)學(xué)院武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧錦州 121000；2．武警后勤學(xué)院病原生物和免疫學(xué)教研室，天津 300309；3．武警后勤學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津 300309；4．武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院口腔教研室，天津 300162）

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R284．1；R329．24；R392．12

摘要：目的 研究葛根素（puerarin）抑制人成骨樣MG-63細(xì)胞分泌IL-6的分子機(jī)制。方法 利用兼有兩種雌激素受體（estrogen receptor，ER）亞型表達(dá)的人成骨樣MG-63細(xì)胞為研究模型，通過(guò)ELISA、RT-PCR、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、小RNA干擾等方法，研究葛根素對(duì)MG63細(xì)胞產(chǎn)生骨吸收調(diào)節(jié)因子IL-6的作用及作用機(jī)制。結(jié)果 葛根素可明顯抑制MG-63細(xì)胞IL-6表達(dá)和IL-6基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，并且該作用可被純ER阻斷劑ICI 182，780部分阻斷。采用小RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步證明葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的上述作用是ERα依賴(lài)的。結(jié)論 葛根素調(diào)節(jié)人成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6主要是ERα依賴(lài)的。

關(guān)鍵詞：葛根素；人成骨細(xì)胞；白細(xì)胞介素-6；雌激素受體α；雌激素受體β；小RNA干擾技術(shù)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．020．html

近年來(lái)，口腔種植技術(shù)發(fā)展迅速，并已經(jīng)成熟為目前口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一門(mén)前沿學(xué)科。種植修復(fù)對(duì)于骨量和骨質(zhì)要求高，因而骨質(zhì)疏松被認(rèn)為是種植成功與否的重要因素。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折的全身性骨病［1］。該病已成為影響老年人健康及生活質(zhì)量的嚴(yán)重問(wèn)題。骨組織是通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的偶聯(lián)活動(dòng)完成自我更新和重建。在正常生理狀態(tài)下，骨吸收和骨形成保持平衡。絕經(jīng)后，婦女雌激素水平下降，骨吸收大于骨形成，從而發(fā)生骨量丟失導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，因此，大量的雌激素缺乏被認(rèn)為是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要原因。雌激素替代治療一度成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的首選，但雌激素的選擇性差，長(zhǎng)期使用可增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)性［2］。故尋找防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有效且副作用小的藥物，成為了目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

葛根系豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，從中提取的單體異黃酮化合物即葛根素（puerarin）。葛根素具有減慢心率、降低血壓、擴(kuò)張血管等作用，臨床上多于心絞痛、高血壓、腦梗死和腦供血不足的治療［3－4］。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，葛根素能明顯促進(jìn)人成骨樣細(xì)胞的增殖和分化［5－6］。在前期工作基礎(chǔ)上，本文以人成骨樣MG-63細(xì)胞為研究模型，該細(xì)胞具有特征性的成骨細(xì)胞功能，并同時(shí)表達(dá)雌激素受體（estrogen receptor，ER）α、β［7］，研究葛根素對(duì)MG63細(xì)胞產(chǎn)生骨吸收調(diào)節(jié)因子IL-6的作用及作用機(jī)制。本文結(jié)果將為探討植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用植物雌激素治療骨質(zhì)疏松癥奠定基礎(chǔ)，也為把骨質(zhì)疏松癥拓為口腔種植的適應(yīng)證而尋求理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1主要試劑 葛根素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；DMEM高糖培養(yǎng)基、活性碳處理的FBS（sF-BS）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為中美合資蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品；TRIzol Rea-gent為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；2×PCR Mixture、2 ×Premix Taq為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、100 bp DNA Ladder Marker為北京天根生物工程公司產(chǎn)品；重組人IL-6、人IL-6 ELISA試劑盒為美國(guó)R＆D公司產(chǎn)品；M-MLV Reverse Tran-scriptase、熒光素酶檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；17-β雌二醇（17β-estradiol，E2）、純ER阻斷

劑ICI 182，780、PMA（phorbol 12-myristate 13-ace-tate）及ONPG均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1．2細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨樣細(xì)胞系MG-63購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。該細(xì)胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100 mg·L－1鏈霉素和100 kU·L－1青霉素。

1．3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和ERα、ERβ基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞克隆的建立 按照LipofectamineTM2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別將pGenesil-ERα shRNA、pGenesil-ERβ shR-NA和pGenesil-scrambled shRNA載體轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選建立MG-63／ERα shRNA、MG-63／ERβ shRNA和MG-63／scrambled shRNA穩(wěn)定低表達(dá)ERα或ERβ的細(xì)胞株［8］。

1．4質(zhì)粒 SV40-β gal是一種帶有β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，其上游亦含有SV40病毒的早期啟動(dòng)子，作為內(nèi)標(biāo)測(cè)量熒光素酶的表達(dá)，消除轉(zhuǎn)染效率不同造成的樣本之間的差異，由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGL2-IL6p（－1200）是一種帶有熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，其上游含有長(zhǎng)約1 200 bp的IL-6基因啟動(dòng)子，由美國(guó)Michigen大學(xué)Evan T Keller教授惠贈(zèng)。

1．5藥物處理細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，更換含有1%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。然后加入不同終濃度的葛根素（0.01、0.1、1 μmol· L－1）、E2（0.1 μmol·L－1）或DMSO處理，各濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用48 h。

1．6ELISA檢測(cè)IL-6 在6孔板中各孔加入細(xì)胞懸浮液2 mL（2.5×108·L－1），按“1.5”的方法處理細(xì)胞后，收集培基上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培基上清中IL-6的含量。

1．7RT-PCR反應(yīng) 在6孔板中各孔加入細(xì)胞懸浮液2 mL（2.5×108·L－1），按“1．5”的方法處理細(xì)胞后，先提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列β-actin、IL-6如文獻(xiàn)［9］所述。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各10 pmol，2×Premix Taq 10 μL，cDNA 1.0 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃30 s變性，59℃45 s退火，72℃1 min延伸，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μL于12 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參照，以靶基因／β-actin光密度的比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)豐度，進(jìn)行半定量檢測(cè)。應(yīng)用Bio-Rad公司的Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1．8細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)按照LipofectamineTM2000的說(shuō)明書(shū)將SV40-β gal和pGL2-IL6p（－1200）共轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，按“1.5”的方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，分別測(cè)定β-半乳糖苷酶及熒光素酶活性，用二者之比作為熒光素酶的相對(duì)活性。

1．9ICI 182，780預(yù)處理細(xì)胞 同“1．5”所示的方法，區(qū)別在于取葛根素的劑量為0.1 μmol·L－1。先加入終濃度為100 μmol·L－1的ER阻斷劑ICI 182，780，37℃作用30 min，然后再加入葛根素。并且設(shè)立ICI 182，780對(duì)照組。

1．10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。各組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行資料圖表處理。

2　結(jié)果

Fig 1 Effect of puerarin on IL-6 expression in MG-63 cells

2．1葛根素對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6基因和蛋白表達(dá)的抑制作用 由Fig 1所示，與對(duì)照組相比，葛根素處理組（0.01、0.1、1 μmol·L－1）IL-6 mRNA表達(dá)水平分別降低了約33%、31%和29%（Fig 1A），相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平分別下降約29%、15%和6% （Fig 1B）。而E2（0.1 μmol·L－1）也能明顯抑制MG-63細(xì)胞IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。上述

結(jié)果提示，作為一種植物雌激素，葛根素可抑制成骨細(xì)胞骨吸收因子IL-6基因和蛋白的表達(dá)，其作用效果與E2類(lèi)似。

2．2葛根素對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響 為進(jìn)一步探討葛根素是否通過(guò)影響MG-63細(xì)胞IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性而抑制IL-6基因和蛋白的表達(dá)，我們將質(zhì)粒pGL2-IL6p（－1200）轉(zhuǎn)染入MG-63細(xì)胞，經(jīng)PMA刺激后，觀察葛根素對(duì)IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用。Fig 2顯示，不同濃度葛根素和E2（0.1 μmol·L－1）均能明顯抑制PMA誘導(dǎo)的IL-6基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素和E2通過(guò)抑制成骨樣細(xì)胞IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性而下調(diào)IL-6基因和蛋白的表達(dá)。

Fig 2 Effect of puerarin on IL-6 promoter activation in MG-63 cells

2．3ICI 182，780對(duì)葛根素抑制MG63細(xì)胞IL-6表達(dá)及其基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響 為了研究葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的上述作用是否由ER通路介導(dǎo)，先用ER阻斷劑ICI 182，780（100 μmol·L－1）處理MG-63細(xì)胞30 min，然后加入葛根素（0.1 μmol· L－1）。而后分別采用RT-PCR和ELISA檢測(cè)IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素能明顯抑制MG-63細(xì)胞IL-6 mRNA（Fig 3A）和蛋白（Fig 3B）表達(dá)水平，而ICI 182，780可部分阻斷葛根素對(duì)IL-6的抑制作用，ICI 182，780本身對(duì)IL-6的表達(dá)水平影響不大。

此外，本文還研究了ICI 182，780對(duì)葛根素抑制MG63細(xì)胞IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性作用的影響。Fig 4顯示，ICI 182，780亦可部分阻斷葛根素對(duì)PMA刺激的IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，同樣，ICI 182，780本身對(duì)IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性作用不明顯。該結(jié)果表明，葛根素通過(guò)調(diào)控IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制IL-6基因和蛋白的表達(dá)，這一作用是ER途徑介導(dǎo)的。

Fig 3 Puerarin-inhibited osteoblastic IL-6 expression is blocked by the ER antagonist ICI 182，780

Fig 4 Puerarin-inhibited osteoblastic IL-6 promoter activation is blocked by the ER antagonist ICI 182，780

2．4葛根素對(duì)成骨細(xì)胞IL-6表達(dá)的抑制作用由ERα介導(dǎo) 應(yīng)用MG-63及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，

本文還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，葛根素能明顯抑制未轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞與MG-63／scrambled shRNA細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)水平，而在兩組間抑制作用差異無(wú)顯著性；與MG-63／scrambled shRNA細(xì)胞相比，葛根素對(duì)MG-63／ERα shRNA細(xì)胞IL-6 mRNA水平的抑制作用明顯減弱，而對(duì)MG-63／ERβ shRNA細(xì)胞的作用并無(wú)影響（Fig 5）。

葛根素對(duì)IL-6蛋白表達(dá)水平的影響與其基因表達(dá)水平基本一致，即葛根素對(duì)MG-63／ERα shRNA細(xì)胞IL-6產(chǎn)生的抑制作用較MG-63／scrambled shR-NA細(xì)胞明顯減弱（P＜0.05），而這一現(xiàn)象并沒(méi)有發(fā)生在MG-63／ERβ shRNA細(xì)胞上（Fig 6）。該結(jié)果表明葛根素對(duì)成骨細(xì)胞IL-6基因和蛋白表達(dá)的抑制作用主要是ERα依賴(lài)的。

Fig 5 Effect of puerarin on IL-6 gene expression in MG-63／ERα shRNA and MG-63／ERβ shRNA cells

Fig 6 Effect of puerarin on IL-6 protein secretion in MG-63／ERα shRNA and MG-63／ERβ shRNA cells

3　討論

雌激素替代療法是目前臨床防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的首選方案，但長(zhǎng)期使用雌激素可引發(fā)對(duì)乳腺、子宮及卵巢的毒副作用。因此，具有骨靶向性的雌激素類(lèi)藥物已經(jīng)成為目前抗骨質(zhì)疏松藥物研究的熱點(diǎn)之一。

葛根素和大豆異黃酮同屬植物雌激素，二者結(jié)構(gòu)極其相似，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失有一定的預(yù)防作用。研究表明［10－11］，大豆異黃酮化合物大豆苷元可抑制去卵巢大鼠骨量丟失，而對(duì)子宮基本無(wú)雌激素樣的刺激作用。故本文推測(cè)，葛根素可能具有和大豆苷元相似的對(duì)骨的藥理活性，但目前尚缺乏對(duì)其作用機(jī)制的深入研究。

作為一種多功能性細(xì)胞因子，IL-6除能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及血管生成等功能外，在骨代謝中也發(fā)揮了重要的作用。IL-6能刺激成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，通過(guò)RANKL與RANK相互作用促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)骨吸收［12］。IL-6的水平與雌激素的水平密切相關(guān)，雌激素能夠通過(guò)抑制IL-6的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝。因此，雌激素水平下降導(dǎo)致的IL-6水平升高，極可能是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要原因之一［13］。臨床和動(dòng)物研究均證實(shí)，葛根素能降低血清IL-6水平，有效改善雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松［14］，然而其抑制IL-6產(chǎn)生的分子機(jī)制尚未闡明。

本文發(fā)現(xiàn)，葛根素通過(guò)降低MG-63細(xì)胞IL-6啟動(dòng)子的活性從而抑制其IL-6的產(chǎn)生。在相同濃度下，葛根素對(duì)IL-6的抑制作用不及雌二醇，其原因可能與二者對(duì)PMA刺激的IL-6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的敏感性不同有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞IL-6基因表達(dá)的抑制作用可能與其下調(diào)NF-κB、NF-IL-6的活性有關(guān)，二者均能上調(diào)IL-6基因的表達(dá)［15］。由此提示，葛根素與雌二醇具有類(lèi)似的生物學(xué)活性，即通過(guò)抑制成骨細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生，阻止破骨細(xì)胞成熟，從而發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松活性。

雌激素對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用是由骨組織上的ER介導(dǎo)的。ER屬核受體超家族成員，其主要成員有ERα和ERβ兩個(gè)亞型。Viereck等［16］研究表明，E2主要通過(guò)活化ERα抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。作為異黃酮類(lèi)植物雌激素，葛根素通過(guò)何種途徑影響成骨細(xì)胞IL-6的分泌？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及IL-6表達(dá)的抑制作用可被ER阻斷劑ICI 182，780部分阻斷。隨后運(yùn)用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步證明葛根素對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6表達(dá)的調(diào)控作用主要是ERα依賴(lài)的。

本文對(duì)葛根素抑制MG-63細(xì)胞IL-6分泌的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，我們的結(jié)果表明，葛根素通

過(guò)ERα介導(dǎo)的途徑抑制成骨細(xì)胞IL-6基因的表達(dá)及蛋白的分泌，進(jìn)而抑制骨吸收。本研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用骨靶向雌激素治療骨質(zhì)疏松癥提供一定的理論依據(jù)，為把骨質(zhì)疏松癥拓為口腔種植的適應(yīng)證提供了一定的理論依據(jù)。

（致謝：本研究的主要工作在本實(shí)驗(yàn)室完成，部分工作在院內(nèi)天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝以上實(shí)驗(yàn)室的幫助。）

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Molecular mechanism for inhibitory effect of puerarin on IL-6 secretion in human osteoblast-like MG-63 cells

LUO ting1，LI Le-fei1，GUO Xiao-qin2，ZHANG Li-peng2，WANG Yue2，LI Ling3，HAN Ze-min4
（1．Liaoning Medical University Postgraduate Training Base，the Affiliated Hospital of Medical College of CPAF，Jinzhou Liaoning 121000，China；2．Dept of Pathogenic Biology and Immunology，College of Logistics，CPAF，Tianjin 300309，China；3．Dept of Pharmacology，College of Logistics，CPAF，Tianjin 300309，China；4．Dept of Stomatology，the Affiliated Hospital of Medical College of CPAF，Tianjin 300162，China）

Abstract：Aim To investigate the molecular mecha-nism for the inhibitory effect of puerarin on IL-6 secre- tion in human osteoblast-likeMG-63 cells．Methods According to our previous studies，human osteoblast-

like MG-63 cells containing two estrogen receptor （ER）isoforms are a suitable model for this study．En-zyme-linked immnosorbent assay（ELISA），RT-PCR，luciferase reporter assay and small interfering RNA were performed to investigate the effect of puerarin on IL-6 expression in osteoblast-derived cells and underly-ing molecular mechanism．Results Puerarin could obviously inhibit IL-6 expression and IL-6 promoter ac-tivity by human osteoblastic MG-63 cells．Treatment with the ER antagonist ICI 182，780 abrogates the a-bove actions of puerarin on osteoblast-derived cells．U-sing siRNA technology，we further demonstrated that the effects of puerarin on IL-6 production were media-ted by ERα．Conclusion The effect of puerarin on IL-6 production in osteoblast is mediated by ERα．

Key words：puerarin；osteoblast；IL-6；ERα；ERβ；siRNA technology

作者簡(jiǎn)介：羅 婷（1989－），女，碩士生，研究方向：口腔種植外科，E-mail：496110748＠qq．com；李樂(lè)飛（1987－），男，碩士生，研究方向：口腔種植外科，共同第一作者，E-mail：heide11111＠163．com；王 越（1968－），女，博士，教授，研究方向：抗骨病藥物分子機(jī)制，通訊作者，Tel：022-84876730；E-mail：wan-gyue6808＠126．com；韓澤民（1967－），男，博士，教授，副主任醫(yī)師，研究方向：口腔種植外科，通訊作者，Tel：022-60578756；E-mail：wjyykq2014163＠．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81273520，81572852，81502256）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 12JCZDJC26300，15JCYBJC28900）；武警后勤學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No WHZ201202，WHB201404，WHB201405，WHB201406，2015ZXKF05）

收稿日期：2015－07－28，修回日期：2015－08－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1524－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．010