蛇床子素通過Wnt／β-catenin信號通路促進轉染APP基因的神經干細胞分化為更多神經元且減少神經元凋亡

姚瓔珈，孔 亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連 116600）

蛇床子素通過Wnt／β-catenin信號通路促進轉染APP基因的神經干細胞分化為更多神經元且減少神經元凋亡

姚瓔珈，孔 亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連 116600）

中國圖書分類號：R284．1；R322．8；R329．25；R341；R394.2；R745.702.6

摘要：目的 通過轉染APP基因于神經干細胞，研究蛇床子素對其增殖和分化能力的影響，及對神經元凋亡的影響，并研究其機制。方法 體外建立阿爾茨海默病的神經干細胞模型，利用免疫組化染色法，研究蛇床子素對轉染APP基因的神經干細胞增殖和分化能力的影響；通過CCK-8法檢測神經干細胞存活率；Hoechst 33258法檢測神經元凋亡情況；RT-PCR法檢測GSK-3β和β-catenin mRNA的表達變化情況；Western blot法檢測GSK-3β和β-catenin蛋白的表達變化情況。結果 與APP組相比，蛇床子素組的神經干細胞增殖能力提高了10.24%；分化為神經元的能力提高了6.74%。與APP組相比，蛇床子素組神經干細胞的存活率明顯提高；神經元凋亡明顯減少；RT-PCR和Western blot結果顯示，蛇床子素可抑制GSK-3β基因和蛋白的表達，促進β-catenin基因和蛋白的表達。結論 蛇床子素可促進轉染APP基因的神經干細胞的增殖，可促進其分化為更多的神經元，并減少神經元凋亡，可能與通過激活Wnt／β-catenin信號通路有關系。

關鍵詞：阿爾茨海默?。簧窠浉杉毎?；增殖；分化；神經元；蛇床子素；Wnt／β-catenin信號通路

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．018．html

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是最常見的一種與年齡有關的癡呆病，AD主要的病理特征是β淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積，神經元纖維的纏結（NFTs）和大量神經元的丟失［1］。AD的病理特征為認知功能退行性病變和記憶、學習能力的下降，且中老年人群中發病率較高［2－3］。神經再生是一個由神經干細胞產生新的神經元的過程［4］，保持著神經干細胞的增殖、遷移和分化為神經元功能之間的平衡，很多神經退行性疾病正是因為此功能下降導致的。那么，提高大腦內內源性神經干細胞的存活和增殖能力，補充丟失的神經元，將是一個非常有潛力的治療途徑。我們之前的研究已經證明了蛇床子素（osthole，Ost）對正常狀態下的神經干細胞的增殖和分化的影響，可減少Aβ孵育的神經細胞中Aβ蛋白的表達［5］，這為后續實驗提供了實驗依據?？扇苄訟β寡聚體的沉積和神經元的丟失是導致AD認知功能障礙的主要致病因素［6］?，F有大量文獻證明，與AD發生有關的這些有毒性的Aβ是由Aβ前體樣蛋白（APP蛋白）通過β-分泌酶和γ-分泌酶水解而產生的［7］。體內還存在與APP蛋白結構相似的APLP1［8］和APLP2［9］蛋白。大量的文獻表明，AD的發生是與Wnt／β-catenin信號通路介導的Aβ產生神經毒性有關［10］。

Wnt／β-catenin信號通路參與了細胞的增殖、分化、神經元凋亡等，且在AD的發生和發展中發揮著重要作用。Wnt信號通路存在兩種途徑：一種是經典Wnt途徑，另一種是非經典Wnt／PCP或者Wnt／Ca2＋途徑［11］。GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，也是Wnt／β-catenin信號通路上重要的媒介，它對細胞蛋白的合成、增殖、分化和凋亡等均有影響。Toledo等［12］已經通過體內實驗發現，氯化鋰作為GSK-3β的抑制劑，激活Wnt信號通路，上調β-catenin表達水平，同時減輕AD模型APPswe／PSEN1ΔE9雙轉基因小鼠的空間記憶障礙，減少Aβ聚集。Balaraman等［13］發現在AD患者腦內，Wnt／β-catenin通路活性處于抑制狀態，導致GSK-3β表現出高活性。β-catenin為該信號通路上一個關鍵點，它是GSK-3β下游靶點，在AD中明顯下降。它的丟失將破壞增殖、生長，引起神經元的死亡［14］。β-catenin代表著經典Wnt／β-catenin信號通路，對神經發生和發展有重要的作用［15］。因此，通過刺激內源性神經干細胞的再生和增殖將是治療AD的一種有效的治療途徑。

蛇床子素（7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，ost-

hole，Ost）化學式：C15H16O3，分子質量：244.38 u，是一種從多種中藥如蛇床子（Angelica pubescens Maxim．f．biserrata Shan et Yuan）中提取的天然香豆素，現如今確定的藥理作用包括抗炎、調節免疫作用等［16－17］。我們之前的研究已經證明，Ost能夠減輕神經細胞由Aβ產生的神經毒性［4］，又可提高以神經干細胞為基礎實驗性的自身免疫性腦脊髓炎的治療效率［18］。

在之前的研究中，我們發現Ost對正常狀態下的神經干細胞具有促進其增殖和分化的作用，但是，Ost對由APP轉染產生Aβ的神經干細胞增殖、分化和遷移能力的報道卻少見。因此，我們想通過實驗證明Ost可提高轉染APP基因的神經干細胞的增殖和存活能力，并促進其分化為神經元，減少神經元凋亡，這將為Ost預防和治療AD提供新的理論依據。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1試劑 Ost（批號：110822－200305，純度＞98%，244.39分子質量；結構見Fig 1）購自于中國藥品檢驗所（北京，中國）；DMEM／F12培養基、胎牛血清（FBS）、雙抗（100 kU·L－1青霉素＋100 mg·L－1鏈霉素）（美國Gibco公司）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（美國Peptide公司）；B27添加劑（B27）（美國Invitrogen公司）；DM-SO（美國Sigma公司）；LiCl（上海生工生物公司）；IWR-1-endo（美國Selleck公司）；CCK-8試劑盒（美國Dojindo公司）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體、兔抗干細胞關鍵蛋白（SOX2）抗體（美國Millipore公司）；Cy3標記驢抗兔IgG抗體（美國Jackson公司）；兔抗Ki67抗體、兔抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、兔抗少突膠質細胞前體蛋白（NG2）抗體、兔抗神經元核（NeuN）抗體（北京博奧森公司）；Hoechst 33258試劑（北京碧云天公司）；第一鏈cDNA合成（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）試劑盒和PCR引物擴增（PCR Master Mix Kit）試劑盒（美國Thermo公司）；全蛋白提取試劑盒、Braford法檢測蛋白濃度試劑盒、蛋白緩沖液上樣試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

Fig 1 Chemical structure of osthole

1．1．2動物 自然分娩48 h內的小鼠（SPF級昆明種小鼠），體質量2～3 g，購自大連醫科大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（遼）2008－0002。

1．1．3儀器 倒置熒光生物顯微鏡（日本尼康公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；CO2培養箱（型號：NU-4750E，美國Nuaire公司）；紫外－可見光分光光度計（型號：UV-5600，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；酶標儀（型號：MR-96A，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；PCR儀（型號：MG96G，杭州朗基科學儀器有限公司）；凝膠成像儀（型號：4100，上海天能科技有限公司）；水平核酸電泳儀（型號：PowerPac系列，美國Bio-Rad公司）。

1．2方法

1．2．1實驗分組 將細胞隨機分為7組，每組3個復孔，重復3次。分別為：①GFP組；②APP組；③Ost組；④LiCl組；⑤APP＋LiCl組；⑥IWR-1-endo組；⑦IWR-1-endo＋Ost組。

1．2．2蛇床子素的配制 Ost溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，DMSO濃度最大比例不超過0．1%。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）液稀釋成濃度為1 nmol· L－1Ost母液，并在－20℃儲存備用［19］。本實驗中APP組細胞經過DMSO溶劑處理，且DMSO體積與給藥組的DMSO體積相等，即APP組為溶劑（DM-SO）對照組。

1．2．3神經干細胞的培養 取新生2 d內乳鼠的腦室下區（SVZ）和海馬區（hippocampus）［20］，然后將神經干細胞培養在完全培養基內，完全培養基包括1%B 27、20 μg·L－1bFGF、20 μg·L－1EGF和100 kU·L－1的雙抗。分離純化的神經干細胞以1 ×109個·L－1的密度接種于24孔板，放在37℃、5%CO2和95%空氣的培養箱內開始培養［21］。在3 d后半量換液，然后細胞開始慢慢地懸浮成長為神經干細胞。

1．2．4APP基因轉染 第3代的神經干細胞用于后續實驗，我們的實驗要通過慢病毒轉染1個與AD致病因素有關的APP質粒［22］，此方法已經成功用于IL-10轉染神經干細胞［23］和CCR5轉染骨髓源神經干細胞［24］。先將GFP和APP質粒用試劑脂質體2000來包裝293T細胞，在24 h后，熒光顯微鏡下觀察熒光情況。在36、72 h后收集上清病毒液，并將神經干細胞打散為單個細胞，用于轉染GFP和APP基因，在轉染3 d后，熒光顯微鏡下觀察轉染情況。

1．2．5熒光免疫組化染色和Hoechst 33258染色96孔板培養的神經干細胞在4℃，用4%多聚甲醛

固定30 min，然后用PBS液清洗，再用1%Triton室溫透化30min［25］。然后選擇相應的一抗抗體：小鼠抗巢蛋白、兔抗星形膠質細胞、兔抗少突膠質細胞、小鼠抗神經元和兔抗Ki67，用1%BSA溶解后4℃孵育過夜，次晨用相對應的二抗孵育1 h后，用PBS液清洗3次。細胞核用4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色15 min。用免疫熒光顯微鏡計數每孔免疫熒光陽性細胞。分化24 h后的細胞再用PBS液溶解Hoechst 33258染料，孵育30 min［26］，凋亡的細胞會出現細胞核內的顆粒塊熒光［27］，從而確定凋亡細胞百分比，每孔實驗重復3次。

1．2．6CCK-8法檢測細胞存活率 神經干細胞的存活率通過CCK-8試劑盒檢測［28］，打散的單個神經干細胞以每孔5×107個·L－1細胞密度接種于96孔板，每組重復3孔。不同組別在培養箱內孵育48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，再培養4 h。在450 nm波長處，用酶標儀檢測吸光度，該吸光度的數值大小與神經干細胞存活的數量密切相關。

1．2．7RT-PCR檢測相關基因的表達情況 提取轉染了APP和GFP基因神經干細胞的總RNA，根據說明書，加入1 mL TRIzol試劑，然后用第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄成cDNA。我們所用引物純度幾乎接近100%，所用引物序列為：APP-F（5′-GACTGACCACTCGACCAGCAGGTTCTG-3′），APP-R （5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3′）；GSK-3β-F（5′-CAACAGCCACCCCAAGAC-3′），GSK-3β-R （5′-GATCCCATCTGGTCATCC-3′）；β-catenin-F（5′-CCACTCCAGGAATGAAGG-3′），β-catenin-R（5′-AG-CAGTCTCATTCCAAGC-3′）；β-actin-F（5′-GG-GAAATCGTGCGTGACAT-3′），β-actin-R（5′-TCAG-GAGGAGCAATGATCTTG-3′）。使用PCR試劑盒進行35個循環的PCR反應［5］。用Image J圖像分析軟件對條帶進行吸光度掃描，結果用相對光密度表示，相對光密度＝光密度目的基因／光密度β-actin。

1．2．8免疫蛋白印跡法檢測相關蛋白的表達情況神經干細胞用預冷的PBS液清洗，然后加入蛋白抑制劑，根據總蛋白提取試劑盒的說明書提取總蛋白，然后通過Braford方法檢測總蛋白濃度［29］。每孔加入100 μg蛋白，用8%烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上［30］，用一抗抗體和適合的辣根酶標記過的二抗抗體孵育，PVDF膜用二氨基聯苯胺（DAB）染色試劑盒染色。用Image J圖像分析軟件對條帶進行吸光度掃描，結果表示蛋白表達量變化情況。

1．2．9統計學分析 統計數據分析使用的是SPSS 13.0軟件，數據以平均數±方差表示，對所得數據進行單因素方差分析和t檢驗。所有的實驗數據都獨立重復至少3次。

2　結果

2．1轉染神經干細胞中APP和GFP的表達 我們從C57BL／6新生乳鼠的SVZ和海馬區分離提取神經干細胞，在大約d 7，神經干細胞增殖為半徑更大的神經球。第3代典型的神經球用免疫組化染色法染色，共同表達神經干細胞特異性標志物Nestin（綠色）和Sox2（紅色），見Fig 2A。然后用APP和GFP慢病毒轉染神經干細胞，質粒結構圖如Fig 2B。神經干細胞轉染APP基因的轉染率大概為85% （Fig 2C），大量表達APP基因和APP蛋白，見Fig 2D和2E。

2．2蛇床子素可促進轉染APP基因的神經干細胞增殖 Ost具有明顯的促進神經球形成的作用（Fig 3A）。我們將第5代神經干細胞在d 1、4、8、12、15采用機械法將其打散為單個細胞，并在增殖培養基內培養，通過對單個細胞的計數，繪制生長曲線圖［19］。Fig 3B生長曲線顯示Ost促進轉染APP基因的神經干細胞數目的增多。在d 7，用Ki67染色法檢測其增殖能力［31］，見Fig 3C。結果發現，與正常組相比，APP組Ki67陽性率明顯下降了24.80% （P＜0.01）；給藥組Ki67陽性率比APP組明顯增強了10.24%（P＜0.05），見Fig 3D。

2．3蛇床子素可促進轉染APP基因的神經干細胞分化為更多的神經元 為了證明Ost（100 μmol· L－1）對體外轉染APP質粒的神經干細胞分化能力的影響，我們將打散后的單個細胞放在分化培養基內培養。大約在12d后，通過免疫組化法檢測神經干細胞分化為星形膠質細胞（GFAP＋）、神經元（Ne-uN＋）和少突膠質細胞（NG2＋）的情況［32］，見Fig 4A。根據定量分析后可得（Fig 4B），Ost作用后神經干細胞分化為更少的星形膠質細胞（APP組vs Ost組：62.67%±2.05%vs 54.27%±1.79%，P＜0．01）和更多的神經元（APP組vs Ost組：19.53% ±2.25%vs 26.27%±3.19%，P＜0.05），但是對少突膠質細胞無明顯影響（APP組vs Ost組：29.9%± 2.85%vs 28.2%±1.68%）。

Fig 2 Transduction of NSCs for APP and GFP expression

Fig 3 Osthole promotes APP transduced NSCs proliferation in vitro

2．4蛇床子素通過Wnt／β-catenin通路提高神經干細胞存活率并且減少神經元凋亡 為了驗證Ost是否通過Wnt／β-catenin信號通路來提高神經干細胞的存活率，我們在實驗中用Wnt通路的抑制劑來阻斷通路信號和Wnt通路的激動劑來激活信號。神經干細胞用Ost（100 μmol·L－1）、IWR-1-endo

（Wnt信號通路抑制劑，10 μmol·L－1）和LiCl（20 mmol·L－1）作用后［33］，我們采用免疫熒光染色法檢測，繪制出凋亡細胞百分比，見Fig 5A和5B，結果顯示Ost作用后，降低了神經元的凋亡。然后，再將細胞重新接種后的d 3采用CCK-8試劑孵育4 h，檢測細胞存活率。正如Fig 5C所示，LiCl組、Ost組、LiCl＋Ost組的細胞存活率與APP組相比有明顯升高（85.76%±4.02%、77.30%±3.41%、94.02%± 4.12%vs 69.03%±3.98%，P＜0.05，P＜0.01），IWR-1-endo組、IWR-1-endo＋Ost組的存活率與APP組相比有明顯下降（53.03%±3.19%、54.25% ±4.03%vs 69.03%±3.98%，P＜0.05），但是IWR-1-endo組和IWR-1-endo＋Ost組之間的細胞存活率差異無顯著性。

Fig 4 Osthole promotes differentiation into greater number of neurons

Fig 5 Osthole promotes the survival of transfected NSCs and reduces neuronal apoptosis

Fig 6 Effects of various treatment on the expression of GSK-3β，β-catenin mRNA and protein

2．5蛇床子素激活Wnt信號通路并抑制GSK-3β活性 Fig 6結果顯示，Ost能夠降低轉染APP質粒的神經干細胞中GSK-3β的mRNA表達，使β-cate-nin的mRNA表達升高。正如這樣的情況，LiCl作用后，β-catenin蛋白增多。當用抑制劑IWR-1-endo作用后，GSK-3β mRNA及GSK-3β蛋白表達升高，但是與給藥組之間相比無明顯變化。

3　討論

AD是一種神經退行性疾病，在工業大國約有2%的人口會得此病，并且這個數目在50年內會翻兩倍［34］。通過查閱文獻，我們知道與AD有關的Aβ是由APP蛋白水解產生的，而這些有毒性的Aβ寡聚體沉積與AD病人的認知功能下降有密切關系［35］。Ost是一種天然香豆素類化合物，因為具有不同的藥理作用，被認為具有強大的治療潛能［36］。根據已知的Ost的藥理作用，例如抗炎［17］、抗氧化［37］和神經保護作用［38］，還有我們之前實驗研究發現，Ost可促進正常狀態下的神經干細胞的增殖和分化，那么，我們通過成功構建一種模擬AD病理特點的體外AD細胞模型，來研究Ost對轉染APP的神經干細胞的增殖和分化能力的影響。

通過實驗，我們發現由APP產生的Aβ寡聚體會抑制神經干細胞的增殖和分化。通過Ki67染色法發現，與APP組相比，Ost組的增殖能力明顯提高，并分化為更多神經元，但兩組比較，分化為少突膠質細胞的能力差異無顯著性。

為了探索Ost的作用機制，我們選取了Wnt／β-catenin信號通路上的激動劑和抑制劑。利用NeuN 和Hoechst 33258染色，神經元凋亡數目的結果說明Ost具有抗神經元凋亡的作用。再用CCK-8試劑盒檢測神經干細胞的存活率，我們的結果顯示，Ost可促進神經干細胞的存活率，但IWR-1-endo組和IWR-1-endo＋Ost組之間的細胞存活率差異無顯著性。為了進一步了解Ost抗神經元凋亡的分子機制，我們隨后利用RT-PCR技術檢測了Wnt／β-cate-nin信號通路上的基因。本實驗的結果表明，在LiCl 或Ost作用后，GSK-3β的mRNA表達下降，而β-catenin的mRNA表達上升。我們又用Western blot技術檢測了GSK-3β、β-catenin蛋白表達，Western blot結果與RT-PCR結果是一致的。以上結果說明

Ost是通過激活Wnt／β-catenin信號通路，抑制GSK-3β活性，并激活β-catenin活性，在體外發揮減少神經元凋亡的作用。

一直以來，AD的發病機制尚未清楚，所以對神經干細胞用于AD潛在治療的研究已經遠遠落后于其他神經退行性疾病。為了發現Ost是通過激活Wnt／β-catenin信號通路，促進神經干細胞的增殖和存活能力，提高向神經元的分化能力，并且減少神經元的凋亡，我們使用了Wnt／β-catenin信號通路的激動劑和抑制劑，證明了Ost發揮藥理作用是與此通路有關。從所有結果來看，Ost將會是一種非常具有潛能用于治療AD或者其他神經退行性疾病的藥物。

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Osthole promotes differentiation into neurons and reduces neuronal apoptosis via Wnt／β-catenin signaling pathway in APP transduced neural stem cells

YAO Ying-jia，KONG Liang，JIAO Ya-nan，LI Shao-heng，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
（Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of osthole （Ost）on the ability of proliferation and differentiation in APP transduced neural stem cells（NSCs），and neu-ronal apoptosis，in order to find related mechanism．Methods A model of Alzheimer′s disease（AD）cells was successfully established by transducing APP gene into NSCs in vitro．The ability of proliferation and dif-ferentiation was tested by staining．The viability of NSCs was determined by using CCK-8 assay．The cell apoptosis was tested by Hoechst 33258 staining．The expression of GSK-3β and β-catenin mRNA was deter-mined by RT-PCR．The expression of GSK-3β and β-catenin protein was determined by Western blot．Re-sults The ability of proliferation had increased by 10．24%with Ost treatment，compared with APP group． The ability of differentiation had increased by 6．74% with Ost treatment，compared with APP group．The vi-ability of NSCs had increased and cell apoptotic rate had decreased significantly．From the results of RT-PCR and Western blot，we could find the expression of GSK-3β mRNA and protein had decreased，and the ex-pression of β-catenin mRNA and protein had increased significantly，compared with APP group．Conclusion Ost could enhance the ability of proliferation and dif-ferentiation into more neurons of NSCs transducing APP gene，and reduce neuronal apoptosis．It might be relat-ed with activiting Wnt／β-catenin signaling pathway．

Key words：Alzheimer′s disease；neural stem cells；proliferation；differentiation；neurons；osthole；Wnt／β-catenin signaling pathway

作者簡介：姚瓔珈（1990－），女，碩士生，研究方向：神經藥理學，E-mail：yaoyj23＠qq．com；楊靜嫻（1963－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經藥理學，通訊作者，Tel：0411-87586009，E-mail：jingx-ianyang＠yahoo．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81173580）

收稿日期：2015－06－11，修回日期：2015－07－20

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1516－08

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．009