覆盆子活性成分山奈酚的含量測(cè)定*

★　謝一輝第一作者：謝一輝(958—),男，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥活性成分分析。E-mail:436985@qq.com。　丁妍華　練波　余斌　樊浩通信作者：樊浩(980—)男，副教授，博士。研究方向：中藥現(xiàn)代鑒定技術(shù)、生物傳感器。E-mail:05095500@qq.com?！?.江西中醫(yī)藥大學(xué)　南昌 330004；.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)?！∧喜?3300)

覆盆子活性成分山奈酚的含量測(cè)定*

★謝一輝1*第一作者：謝一輝(1958—),男，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥活性成分分析。E-mail:243619851@qq.com。丁妍華1練波1余斌2樊浩1*通信作者：樊浩(1980—)男，副教授，博士。研究方向：中藥現(xiàn)代鑒定技術(shù)、生物傳感器。E-mail:105095500@qq.com。(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004；2.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校南昌 330012)

摘要：目的：建立覆盆子改善腎陽虛型癡呆活性成分山奈酚的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 266nm，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果:山奈酚質(zhì)量在0.0782～5.000μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.50%，RSD=2.1%。 結(jié)論:試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該方法可作為覆盆子有效成分山奈酚含量測(cè)定的方法。

關(guān)鍵詞：覆盆子；高效液相色譜法；山奈酚；老年癡呆

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果實(shí)。性微溫、味甘、酸，歸肝、腎經(jīng)，具補(bǔ)肝益腎、固精縮尿、明目之功效，許多抗衰古方中含有覆盆子。據(jù)現(xiàn)代藥理研究，覆盆子具有改善學(xué)習(xí)記憶能力、延緩衰老[1]、抗誘變[2]、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、溫腎助陽等作用，其含有多種抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)整物質(zhì)代謝等作用的成分[3]。

課題組前期研究表明：覆盆子以及覆盆子有效組分可顯著地改善腎陽虛型癡呆大鼠在morris水迷宮中的定位航行與空間探索能力，有效地保護(hù)腎陽虛癡呆動(dòng)物的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元使其免受損傷，明顯減少細(xì)胞tau蛋白異常表達(dá)[4]，起到改善腎陽虛型癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[5-6]，改善腎陽虛型癡呆等功效較為顯著。研究表明覆盆子有效成分為乙酸乙酯部位中黃酮類成分，而山奈酚是覆盆子黃酮中含量最高、活性最強(qiáng)的活性成分[7]。從覆盆子中提取的單體成分進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，山奈酚顯著性保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受H2O2的損傷，而且在所有單體成分中活性最高。后期將進(jìn)行覆盆子活性成分防治老年腎陽虛型癡呆的作用機(jī)制和組分配伍研究。為保證后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可靠、穩(wěn)定，必須要求覆盆子藥材所含量成分，特別是最主要的活性成分山奈酚含量穩(wěn)定。有必要建立覆盆子活性成分山奈酚的含量測(cè)定方法。對(duì)覆盆子質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，有利于后續(xù)對(duì)覆盆子進(jìn)行深入研究，也有利于臨床用藥的安全有效。

1儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀；Sartorius BS214-D天平(萬分之一)；Mettler AE240天平(十萬分之一)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；自動(dòng)三重蒸餾水器(上海亞榮生化儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；Du-650紫外可見光譜儀(美國(guó)貝克曼公司)。

山奈酚對(duì)照品(自提，PHLC歸一化純度為：99.59%)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。覆盆子藥材購于樟樹、九江、湖南等地，經(jīng)劉慶華老師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果實(shí)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 266nm，進(jìn)樣量：20μL。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按山奈酚計(jì)算不低6 000, 山奈酚與相鄰組分峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1-2。

圖1　覆盆子樣品HPLC圖

圖2　山奈酚對(duì)照品HPLC圖

2.2對(duì)照品溶液的制備稱取山奈酚對(duì)照品約10mg，精密稱定。置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液，并稀釋至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL。

2.3供試品溶液的制備精密稱取覆盆子粉末約2g，精密稱定。加甲醇60mL于水浴回流1h,放冷至室溫，濾過，濾液于蒸發(fā)皿中蒸干，精密加入甲醇2mL, 稱重，水浴加熱使殘?jiān)芙?，放冷，加甲醇補(bǔ)足重量，即得。

2.4線性關(guān)系的考察取上述對(duì)照品液，配制成9個(gè)不同濃度的山奈酚對(duì)照品液，含量分別是：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91 μg/mL。取上述對(duì)照品液各20μL，按2.1色譜條件測(cè)定各對(duì)照液的峰面積。以對(duì)照品重量為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到山奈酚回歸方程式為：Y=2618.05X-50.625，r=0.9999，結(jié)果表明山奈酚在0.0782～5.000μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，每次進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定山奈酚峰面積值，峰面積RSD為1.7%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取覆盆子粉末6份，每份約2g，精密稱定。按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示：山奈酚平均含量約為20μg/g，RSD值為0.86%(n=6)，表明該法重復(fù)性好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品品溶液，常溫放置，分別于0,2,4,8,12,24h，按2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算出山奈酚的含量，RSD=2.3%，表明供試品溶液中山奈酚在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.1%(n=9)，結(jié)果見表1。

2.9樣品含量測(cè)定取5個(gè)產(chǎn)地的了覆盆子藥材細(xì)粉各約2 g，精密稱定。按2.3條件制備供試溶液, 按2.1條色譜條件進(jìn)樣分析, 計(jì)算山奈酚的含量, 結(jié)果見表2。

表2　不同產(chǎn)地覆盆子的含量測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取山奈酚對(duì)照品溶液在190～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，山奈酚在266nm處有最大吸收，故選266nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相考察比較了不同酸堿性的流動(dòng)相，結(jié)果顯示采用酸性流動(dòng)相, 可有效提高柱效, 改善峰形，減少山奈酚的色譜峰拖尾現(xiàn)象, 而其中以0.1%磷酸水溶液的分離效果最佳。比較了不同配比和不同酸度的甲醇水、甲醇酸水、乙腈水和乙腈酸水，結(jié)果顯示乙腈∶0.1%磷酸= 30∶70所組成的流動(dòng)相分離效果最佳。

3.3供試品溶液制備方法的選擇考察了甲醇超聲、索氏提取、乙醇回流和甲醇回流4種提取方法，結(jié)果表明甲醇回流山奈酚含量最高，雜質(zhì)峰相對(duì)較少。曾試用硅膠柱、反相填料柱、聚酰胺柱、硅藻土的預(yù)處理甲醇回流液，以除去提取液的雜質(zhì)，因經(jīng)上述處理后，山奈酚易損失，故直接將回流液濃縮定容后測(cè)定。

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2 083-2 084.

Quantitative Determination of Active Ingredient Kaempferol inRubusChingiiHu

XIE Yi-hui1,DING Yan-hua1,LIAN Bo1,YU Bin2,FAN Hao1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiChemicalIndustrySchool，Nanchang330012,China.

Abstract:Objective: To establish method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu. Methods: Using high performance liquid chromatography. The column was Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm),mobile phase: acetonitrile-0.1% phosphoric acid in water (30∶70),flow rate: 1mL/min, column temperature:30℃, detection wavelength:266nm, the injection volume:20μL.Results: The quality of Kaempferol ranged from 0.0782μg to 5.000μg. Peak area showed a good linear relationship (r=0.9999) and the average sample recovery rate was 99.50%, RSD=2.1%.Conclusion: The method is simple, rapid and accurate, which can be used as an effective method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu.

Key words:Rubus Chingii Hu；PHLC；Kaempferol；Senile Dementia

收稿日期：(2014-11-10)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：*江西省自然科學(xué) (20142BAB205025)；江西中醫(yī)藥大學(xué)“道地藥材及特色中藥資源研究專項(xiàng)”。