不同時程海洛因依賴大鼠胃竇CD4、CD8和IL-2表達*

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不同時程海洛因依賴大鼠胃竇CD4、CD8和IL-2表達*

網絡出版時間：2015-03-19網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0959.017.html

夏白娟， 李一欣， 洪艷， 韓晶， 梁文妹

(貴陽醫學院 組織學與胚胎學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討海洛因依賴期間大鼠胃竇內CD4、CD8及白細胞介素-2(IL-2)的表達。方法： 正常成年SD大鼠，隨機分為正常對照組(NCG)、鹽水對照組(SCG組)和不同時程海洛因依賴組(HDG組)；采用免疫組織化學SABC法及圖像分析法，觀察SCG組和HDG組造模第10、17、24、31及38天時大鼠胃竇黏膜CD4、CD8和IL-2表達。結果： 與NCG組及SCG組比較，HDG組大鼠胃竇CD4、IL-2 陽性細胞數量減少，染色變淺，圖像分析的細胞計數和平均灰度值差異也有統計學意義(P<0.05)；HDG組大鼠胃竇CD8陽性細胞較NCG及SCG組細胞數量增多，染色變深，在海洛因依賴第24天變化最為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。結論： 在海洛因依賴期間，CD4、IL-2 在胃竇表達減弱，CD8表達增強，提示海洛因依賴對大鼠胃黏膜免疫功能造成損傷。

[關鍵詞]CD4陽性T淋巴細胞； CD8陽性T淋巴細胞； 白介素2； 胃竇； 海洛因； 大鼠，Sprague Dawley

阿片類物質濫用可對成癮者消化系統造成明顯的損害，引起胃腸蠕動減慢、消化道潰瘍及胃腸功能紊亂等癥狀，可能與胃腸道的免疫功能降低有關[1-3]。T淋巴細胞在機體免疫中起著重要作用，主要包括CD4和CD8淋巴細胞兩大亞群。分布在胃腸黏膜的CD4和CD8淋巴細胞能保護黏膜，防御病原菌的入侵。IL-2(interleukin-2)則是由CD4產生的一種細胞因子，能活化巨噬細胞，參與免疫防御。課題組前期研究曾報道過海洛因戒斷、脫毒和復吸期間CD4、CD8和IL-2 在大鼠胃竇的表達變化，但目前對不同時程海洛因依賴大鼠胃黏膜免疫功能影響的研究少見報道，本實驗通過建立相關大鼠模型，觀察不同時程海洛因依賴期間(10、17、24、31、38 d)，CD4、CD8和IL-2在大鼠胃竇的表達，探討海洛因依賴期間胃黏膜免疫功能的變化。

1材料與方法

1.1　動物分組與試劑

成年雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠66只，體質量180~220 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供；按配對原則隨機分為正常對照組(normal control group，NCG)6只，鹽水對照組(saline control group，SCG)和海洛因依賴組(heroin dependent group, HDG)，各30只。海洛因粉劑，純度61.48%，由貴州省公安廳提供，臨用時用滅菌注射用水溶解。

1.2　方法

1.2.1海洛因依賴大鼠模型 HDG組按體重逐日遞增皮下注射海洛因藥液，首日劑量為3 mg/kg，2次/日(上午8時，下午3時)，每日遞增3 mg/kg，連續注射9 d至成癮，第9天劑量為27 mg/kg。此后每日上午8時皮下注射海洛因一次，維持至取材，劑量為27 mg/kg。SCG組按體重每日注射HDG組相當劑量的生理鹽水。NCG組不予任何處理。

1.2.2標本制備HDG組及SCG組分別于第10、17、24、31、38天取材，(分別為HDG10，HDG17，HDG24，HDG31，HDG38和SCG10，SCG17，SCG24，SCG31，SCG38組)每組每次處死6只，NCG組每次處死一只。取胃竇組織，多聚甲醛液固定，常規石蠟包埋，制成4 μm厚的連續切片。

1.2.3CD4、CD8和IL-2陽性細胞檢測免疫組織化學SABC法，切片常規脫蠟脫水，室溫10%甲醇-H2O210 min，正常羊血清(1∶50)室溫下封閉20 min，分別滴加兔CD4、CD8和IL-2抗血清，4 ℃孵育過夜；羊抗兔 IgG(1∶100)37 ℃孵育20 min，SABC復合物(1∶100)37 ℃孵育20 min，DAB-H2O2液顯色，蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。方法對照采用PBS緩沖液代替特異性抗血清，其余步驟同上。

1.2.4觀察指標隨機選取HDG組各時間點和同期SCG組各胃竇切片3例，NCG組3例于40倍物鏡下，每例切片隨機選取5個視野，大鼠胃竇黏膜中CD4陽性細胞經免疫組織化學染色之后可見免疫反應產物呈棕黃色，分布于黏膜內固有層，胞體小，多呈圓形、橢圓形；CD8陽性細胞經免疫組織化學染色之后可見免疫反應產物呈棕黃色或棕黑色，位于細胞胞膜和胞質內，多分布于胃竇黏膜固有層內；大鼠胃竇IL-2陽性細胞免疫反應產物呈棕黃色或棕黑色細顆粒狀，存在于細胞胞質中，陽性細胞多分布于固有層腺底部的結締組織中。用BioMias圖像分析系統檢測CD4、CD8和IL-2陽性細胞的平均灰度值。

1.3　統計學方法

2結果

2.1　一般情況

在實驗過程中，SCG組和NCG組大鼠皮毛光滑，飲食正常，無拉稀便等現象，體重逐漸增長；HDG組大鼠隨海洛因劑量的遞增，從第10天開始出現典型的海洛因依賴癥狀。表現為：給藥后動物呆滯、活動減少、嗜睡，四肢及軀體肌緊張，尾巴僵直上翹，兩眼凸出、發亮，眼神迷離無光彩，用硬物戳之無反應，類似死后僵硬一般，這些表現持續約30 min；此后開始出現興奮狀態，表現為活動增多，亂竄，快速不停地轉圈運動，舔毛，咬前爪及磕鐵籠等,興奮持續時間約90 min。

2.2　CD4、CD8和IL-2表達

光鏡下， SCG各組和NCG組比較，大鼠胃竇中CD4陽性細胞的分布及免疫染色強度無明顯差別(圖1-A)；HDG組大鼠胃竇黏膜內的CD4陽性細胞數量隨著海洛因依賴時間的延長逐漸減少，且免疫染色強度減弱(圖1-B、圖1-C)。SCG各組大鼠胃竇中CD8陽性細胞的分布及免疫染色強度與NCG組無明顯差別，HDG大鼠胃竇黏膜內CD8陽性細胞在海洛因依賴早期沒有太大變化，于依賴24 d時數量明顯增加，免疫染色有所增強(圖1-D、圖1-E)。與NCG組比較，SCG組IL-2陽性細胞的分布及免疫反應染色強度均無明顯變化，經統計學處理，該兩組平均灰度值無顯著差異(P>0.05)(圖1-F)。海洛因依賴大鼠組胃竇IL-2陽性細胞數量減少(圖1-G、圖1-H)。

A~C為SCG10、HDG31及HDG38組 CD4陽性細胞，D~E為HDG24及HDG38組 CD8陽性細胞；F~H為SCG31、HDG17及HDG24 IL-2陽性細胞圖1　各組大鼠胃竇CD4、CD8、IL-2免疫反應陽性細胞(SABC×400)Fig.1　The CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

2.3　CD4、CD8和IL-2陽性細胞數量

大鼠胃竇黏膜CD4、CD8和IL-2陽性細胞數在NCG與SCG各組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。HDG組CD4和IL-2陽性細胞數量減少，與NCG、SCG比較差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著依賴時間的延長兩種細胞減少的趨勢越明顯，差異有統計學意義(P<0.05)；HDG組CD8陽性細胞數量在海洛因依賴的第10、17天時無明顯變化，在第24天時升高(P<0.05)，此后數量雖有所升高，但差異不具有統計學意義(P<0.05)，且CD4/CD8的比值明顯<1。見表1。

表1　各組大鼠胃竇黏膜中CD4、CD8、IL-2陽性細胞數量

2.4　CD4、CD8和IL-2陽性細胞平均灰度值

CD4、IL-2陽性細胞的平均灰度值在NCG和SCG各組分別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)； CD4陽性細胞和IL-2陽性細胞平均灰度值在HDG組隨著海洛因依賴時間延長而逐漸增加，CD4差異有統計學意義(P<0.05)，而IL-2差異無統計學意義(P>0.05)。HDG組CD8陽性細胞平均灰度值在海洛因依賴第24天之后較NCG和SCG各組和HDG1、HDG2組顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與本組內NCG、SCG各組比較P<0.05圖2　各組大鼠胃竇黏膜中CD4、CD8、IL-2陽性細胞平均灰度值Fig.2　The average gray degree of CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

3討論

CD4淋巴細胞和CD8淋巴細胞參與了機體病毒免疫、抗腫瘤免疫等作用，在正常人體內的比例約為2[7-8]。CD4是輔助性T細胞的表面標志，CD8是殺傷性T細胞的表面標志。在免疫應答過程中，CD8+T細胞發揮細胞毒作用，特異性直接殺傷靶細胞；CD4+T細胞具有協助體液免疫和細胞免疫的功能。兩者既相互聯系、相互促進，又相互制約。其中任何一方異常、免疫調節失衡，即可出現病理狀態。

研究發現阿片類物質對機體免疫系統有抑制作用[10]。對海洛因依賴患者外周血的檢測也發現，CD4淋巴細胞數較正常值降低，CD4/CD8的比值<1[11-12]。本實驗結果CD4淋巴細胞數隨著海洛因依賴天數的增加而逐漸減少，免疫染色變淺，表明海洛因能加速CD4淋巴細胞凋亡使細胞數量減少，與Yin等[13]報道相符。CD8淋巴細胞數及免疫染色強度在海洛因依賴初期變化不明顯，從第24天起細胞數增多，免疫染色逐漸加深，推測可能與CD8 淋巴細胞具有抑制T 細胞活性，對免疫應答有負調節效應有關，CD4/CD8比值的降低也提示胃黏膜免疫防御功能下降[14]。本實驗中，海洛因依賴大鼠胃竇IL-2細胞的細胞數減少，免疫反應強度減弱，與Li HY等[15]的報道相符，表明CD4淋巴細胞數量減少，產生細胞因子IL-2的能力減弱。而IL-2能促進淋巴細胞的增殖，IL-2分泌的減少，對CD4淋巴細胞的增殖造成了影響[16]。在海洛因依賴期間，胃竇黏膜免疫功能受到嚴重損傷，這也是海洛因濫用者容易受病毒、細菌感染而出現相關臨床并發癥的原因之一。

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(2015-01-07收稿，2015-02-23修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

The Expression of CD4, CD8 and IL-2 in Gastric Antrum of

Heroin-dependent Rats in Different Periods

XIA Baijuan, LI Yixin, HONG Yan, HAN Jing, LIANG Wenmei

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of CD4, CD8 and interleukin-2 (IL-2) in gastric antrum of heroin-dependent rats. Methods: Adult SD rats were divided into normal control group (NCG)，saline control group (SCG) and heroin-dependent group (HDG). Immunohistochemical SABC method and imagine analysis technique were performed to detect the expression of CD4、CD8 and IL-2 in the 10th,17th,24th,31stday after establishing heroin-dependent model.Results: The number of CD4, IL-2 positive cells and intensity of immunohistochemical staining of CD4, IL-2 in HDG were decreased, compard with NCG and SCG. The results of imagine analysis showed that the difference of the number and the average gray degree of CD4, IL-2 were statistically significant(P<0.05).Compared with NCG and SCG, the intensity of immunohistochemical staining and the number of CD8 positive cells in gastric antrum in HDG increased, the most obvious change appeared at 24thday of heroin dependence. Conclusions: The expression of CD4, IL-2 in gastric antrum is distinctly reduced, that of CD8 enhance during heroin dependence, suggesting that the immune function of rat antrum is damaged by heroin.

[Key words]CD4 positive T Cells； CD8 positive T Cells； interleukin-2； gastric antrum； heroin; rats,Sprague-Dawley

[中圖分類號]R329.44； R34-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0241-04

[基金項目]*貴州省衛生廳優秀青年基金(No：G2009-11)；貴州省科技廳基金[黔科合J字2010(2153)]