馬鈴薯ARF基因RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化及對其試管薯生理特性的影響

裴瑞芳，劉英，劉柏林，張寧，司懷軍*，王蒂*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，

甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯ARF基因RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化及對其試管薯生理特性的影響

裴瑞芳1,2，劉英1,2，劉柏林1，張寧2，司懷軍1,2*，王蒂1*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，

甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

摘要：用含有ADP核糖基化因子(ARF)基因的干擾載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯2號”，獲得轉(zhuǎn)化植株48株，經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測證明ARF基因已成功整合到馬鈴薯基因組中。用實時熒光定量PCR檢測表明，轉(zhuǎn)化植株中ARF基因的表達較對照均有不同程度的下降，在轉(zhuǎn)基因株系Z-11和Z-12中，ARF基因表達的干擾程度分別高達92.53%和93.22%。對轉(zhuǎn)基因植株誘導的試管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)、蔗糖和葡萄糖含量測定結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因的對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的淀粉含量提高了4.29%~34.27%，蛋白質(zhì)含量提高了1.47%～7.35%，可溶性糖含量提高了1.44%~17.39%；蔗糖含量提高了11.53%~53.84%，而葡萄糖含量降低了6.06%~21.21%。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；ARF基因；干擾載體；轉(zhuǎn)基因植株；生理指標

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)是Ras基因超家族的成員，它們是大小約20 kDa的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，屬于小G蛋白超家族中的ARF亞家族[1-2]。ARF作為霍亂毒素催化GS蛋白ADP核糖基化反應(yīng)的輔助因子，于1982年被Kahn和Gilman最早發(fā)現(xiàn)并純化出該類細胞因子，將其命名為ARF。人們對ARF 結(jié)構(gòu)和功能的研究大部分是通過研究突變體實現(xiàn)的，通過突變體和天然蛋白質(zhì)之間的比較可以精確了解ARF結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，其中最著名的是對酵母雙突變體的研究。近來人們發(fā)現(xiàn)ARF作為磷脂酶D的激活劑[5-6]以及在酵母和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)ARF是構(gòu)成高爾基體轉(zhuǎn)運體系的組分，認為它參與了囊泡轉(zhuǎn)運過程，ARF還對蛋白質(zhì)合成后的運輸發(fā)揮作用并調(diào)控細胞的信號轉(zhuǎn)導。ARF普遍且大量存在于真核生物細胞中，如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、擬南芥(Arabidopsisthaliala)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、藍氏賈第蟲(Giardialamblia)等低等生物以及鼠、牛等哺乳動物和人，其結(jié)構(gòu)和功能在動植物演化發(fā)展中高度保守。目前已在哺乳動物、高等植物和真菌中克隆了多種形式的ARF基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、生理作用、表達調(diào)控作用機制進行了詳細研究，隨著分子生物學的發(fā)展，ARF各種基因和基因產(chǎn)物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。馬鈴薯(Solanumtuberosum)具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強等優(yōu)良特性以及隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷壯大和人們消費結(jié)構(gòu)的變化，馬鈴薯品質(zhì)育種工作正在受到重視。

本研究通過農(nóng)桿菌介導法將組成型表達啟動子CaMV 35S 驅(qū)動的ARF基因的RNA干擾表達載體導入到馬鈴薯栽培品種中以獲得干擾植株，并對其試管薯的淀粉、蛋白質(zhì)、可溶性糖、蔗糖和葡萄糖含量進行測定，以期研究ARF基因?qū)︸R鈴薯生理特性的影響，從而為進一步研究ARF基因在馬鈴薯塊莖中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1植物材料及試管薯的誘導2012年3月培養(yǎng)馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯2號”的試管苗，在無菌條件下剪成帶有2個腋芽的莖段，轉(zhuǎn)接到MS(Murashige and Skoog，MS培養(yǎng)基)+3%蔗糖+0.45%瓊脂的固體培養(yǎng)基上。用150 mL三角瓶培養(yǎng)，每瓶裝50 mL固體培養(yǎng)基，接種5個莖段，2000 lx光照下培養(yǎng)，大約在3周后每個莖段生長成一株帶有5～6個節(jié)的健壯試管苗，把這些健壯試管苗作為誘導試管薯的母株。試管薯的誘導采用固體誘導法，即將培養(yǎng)健壯的植株接入誘導培養(yǎng)基上，誘導培養(yǎng)基由MS附加8%蔗糖組成。待其培養(yǎng)20 d左右，將其置于黑暗、溫度(23±1)℃的條件下進行馬鈴薯試管薯的誘導。

1.1.2菌株和質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 LBA4404由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供，抗性標記為利福平(Rifampicin，Rif)；RNA干擾表達載體pHellsgatearf1(含組成型表達啟動子 CaMV 35S)由劉柏林博士構(gòu)建，抗性標記為卡那霉素(Kanamycin，Kan)和壯觀霉素(Spectinomycin，Spe)。

1.1.3工具酶和主要試劑TaqDNA聚合酶、DNA Marker購自TaKaRa公司，引物由上海生物工程公司合成，RNA提取試劑為天根公司生產(chǎn)的RNA simple Total RNA Kit DP415，cDNA合成試劑為Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Systhese Kit，Real time-PCR試劑購自TaKaRa公司的PrimeScript?RT Master Mix和SYBR?Premix Ex TaqTMII。其余生化藥品分別為Sigma、Invitrogen公司產(chǎn)品及國產(chǎn)分析純。溶液配方及常用抗生素與激素的配置詳見文獻[10]。

1.2　方法

1.2.1農(nóng)桿菌工程菌液的制備挑取培養(yǎng)皿平板上含質(zhì)粒pHellsgatearf1的根癌農(nóng)桿菌LBA4404的單菌落，接種于30 mL LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基，含 50 mg/L 壯觀霉素(Spe)+50 mg/L 利福平(Rif)中，在 28℃、240 r/min下振蕩培養(yǎng)過夜，取1 mL菌液轉(zhuǎn)移到 30 mL LB培養(yǎng)基(含有50 mg/L Spe+50 mg/L Rif)中，28℃、240 r/min 下振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5，于5000 r/min離心6 min，收集沉淀用相同體積液體MS 培養(yǎng)基重新懸浮備用。

1.2.2馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯試管薯薄片遺傳轉(zhuǎn)化方法[11]。

1.2.3轉(zhuǎn)化再生植株的 PCR檢測用 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法提取轉(zhuǎn)化植株和對照植株的葉片總DNA。參照 Sambrook和Russell[10]的方法對抗性植株進行 PCR 檢測。用檢測引物G2A1-F(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCGATCTTCGATTAACGG-3′)和G2A2-R(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTGGCCTTGCTGGCGATGT-3′)進行 PCR 擴增，預(yù)期片段大小為768 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 結(jié)果。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測分別提取DNA檢測呈陽性植株的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。以馬鈴薯ef1a基因為內(nèi)參(擴增引物為ef1a-F：5′-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3′和ef1a-R：5′-TTCCTTACCTGAA CGCCTGT-3′)，以ARF基因序列設(shè)計一對特異性較高的引物ARF-F：5′-GCCTTACCCTTCTTCACTCTCT-3′和ARF-R：5′-CCCATTCCAACATCAGACAC-3′。利用SYBR熒光染料法進行轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測與分析，根據(jù)2-△△Ct方法計算出ARF基因的相對表達量[2]。

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株試管薯生理指標的測定于2013年7月、8月、9月依次誘導轉(zhuǎn)基因試管薯，并在2013年10月、11月、12月分別收獲誘導成功的試管薯3份，貯藏在4℃冰箱中并用于各項生理指標的測定。蔗糖和可溶性糖含量的測定用蒽酮硫酸法[13]。葡萄糖含量的測定用酶比色法[13]。淀粉含量的測定參照張永成和田豐[14]的比重法。可溶性蛋白含量的測定參照李合生[15]的考馬斯亮藍G-250染色法。

試驗均重復3次后收集數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0 專業(yè)版軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1　馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化與生根篩選

圖1　轉(zhuǎn)基因外植體在Kan選擇培養(yǎng)基上芽分化和植株再生　Fig.1　Shoot and plant regeneration from transgenic explants on the selective medium containing kanamycin　　　1：非轉(zhuǎn)基因植株Non-transgenic plant；2：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plant.

試管薯薄片在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后即開始膨大并逐漸變綠，20 d后薯片中央有綠色凸起，30 d后凸起處直接分化出綠色芽點，40 d后在薯片凸起處或周邊有綠色單芽或叢生芽發(fā)出(圖1A)，待抗性芽長至2 cm左右時剪下接入附加有50 mg/L Kan和250 mg/L 羧芐青霉素(Carbenicillin，Carb)的MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，8 d后植株莖段切口處生根(圖1B)，植株能正常生長，對照組外植體基本不能分化出芽，表明再生植株具有Kan抗性，再生植株每20 d在50 mg/L Kan的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次，繼代3次以上均能正常生根及生長的轉(zhuǎn)基因植株為抗性植株，經(jīng)過Kan 3次篩選共篩選出48株抗性植株。

圖2　部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測Fig.2　Detection of some transgenic plants by PCR　　　M：DL2000 marker； 1：質(zhì)粒陽性對照 Positive control of plasmid；2：陰性對照，非轉(zhuǎn)基因植株 Negative control， non-transformed plants；3：H2O對照H2O control；4~13：轉(zhuǎn)化植株 Transformed plants.

2.2　轉(zhuǎn)基因植株檢測與分析

2.2.1轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測用經(jīng)過Kan篩選獲得的48株轉(zhuǎn)化植株的DNA為模板，用引物G2A1和G2A2進行PCR擴增檢測，結(jié)果有38株擴增出特異性目的片段，與從載體質(zhì)粒中擴增出片段大小768 bp相符，而非轉(zhuǎn)化植株未擴增出相應(yīng)條帶(圖2)，初步證明ARF基因已整合到馬鈴薯的基因組中。

2.2.2轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測分析以馬鈴薯ef1a基因為內(nèi)參，采用qRT-PCR法對馬鈴薯塊莖中ARF基因的表達量進行了檢測。結(jié)果表明，ARF基因在轉(zhuǎn)基因植株(Z-1～Z-12)中的表達量較對照(G)達到了顯著的差異(其中Z-10植株除外)，轉(zhuǎn)基因植株中ARF基因的表達都受到一定程度的干擾。從相對表達量來看Z-11、Z-12的干擾程度比Z-1、Z-7的干擾程度更大，其干擾程度分別高達92.53%和93.22%。而轉(zhuǎn)基因株系Z-10中ARF基因的表達量較對照沒有明顯差異(圖3)。

圖3　轉(zhuǎn)基因植株ARF基因表達的qRT-PCR檢測結(jié)果Fig.3　Result of ARF gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay　　　G：對照，非轉(zhuǎn)基因植株Control, non-transgenic plant；Z-1~Z-12：7個不同的轉(zhuǎn)基因株系7 different transgenic plant lines.不同字母表示差異顯著(P<0.05)The different letters mean significant difference at P<0.05.

2.3　轉(zhuǎn)基因植株生理指標的測定

對轉(zhuǎn)基因植株誘導的試管薯的生理指標的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ARF基因株系Z-1、Z-2、Z-5、Z-7、Z-11、Z-12的淀粉含量與對照相比，提高了4.29%～34.27%；而蛋白質(zhì)含量僅有株系Z-2、Z-7、Z-11提高了1.47%~7.35%，其余株系的蛋白質(zhì)含量均有所下降，可溶性糖含量與對照相比提高了1.44%～17.39%；而轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖含量較對照發(fā)生了較大的變化，比對照提高了11.53%～53.84%；葡萄糖含量比對照降低了6.06%～21.21%(表1)。

表1　轉(zhuǎn)ARF基因馬鈴薯試管薯生理指標的測定結(jié)果

G：對照，非轉(zhuǎn)基因植株Control, non-transgenic plant；Z-1~Z-12：6個不同的轉(zhuǎn)基因株系6 different transgenic plant lines.鄧肯氏新復極差法顯著性檢測。同列不同小寫字母表示0.05差異顯著水平，大寫字母表示0.01差異顯著水平。The assay was performed based on Duncan’s new multiple range test. The lowercases following the datum in each column represent statistically significant difference at the 0.05 level. The capitals following the datum in each column represent statistically significant difference at the 0.01 level.

3討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因功能的基本手段，本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法將ARF基因干擾載體轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，對ARF基因的功能進行探索和研究。已有研究表明，ARF是一類在真核生物進化早期出現(xiàn)的高度保守的GTP激酶，它對于分泌性囊泡的形成是必需的，其在內(nèi)吞途徑、生物合成、類脂的代謝、胚胎發(fā)育及物質(zhì)運輸中起重要的調(diào)控作用，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間囊泡運輸中起作用[16]。Naramoto等[17]研究了依賴于ARF GTPase活性的植物細胞的內(nèi)同作用調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)ARF-GEF GNOM 和 ARF-GAP vascular network defective3 (VAN3)參與了植物激素極性運輸介導的胚胎發(fā)生，并將其定位在質(zhì)膜及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)上。Zuk等[18]證實，抑制馬鈴薯AFR基因的表達會導致14-3-3蛋白基因的激活，導致植物的表型以及碳水化合物的含量都會發(fā)生改變，在獲得的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中出現(xiàn)了亞油酸水平的含量顯著增加，同時具有抗氧化能力的酚類物質(zhì)含量也升高。近幾年，隨著分子生物學的發(fā)展，ARF各種基因和基因產(chǎn)物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，以及對其功能的研究也相應(yīng)展開。

本研究通過經(jīng)Kan抗性篩選和PCR初步檢測得到48株轉(zhuǎn)ARF基因干擾植株。Liu等[19]研究分析表明ARF基因在馬鈴薯的塊莖中優(yōu)勢表達，其中在馬鈴薯塊莖中表達量最高。本研究通過qRT-PCR檢測分析ARF基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯試管薯中的表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中ARF基因的干擾程度可達到35.23%～93.22%，尤其在株系Z-11和Z-12中，ARF基因表達的干擾程度分別高達92.53%和93.22%。通過測定其試管薯中的淀粉、蛋白質(zhì)、可溶性糖、蔗糖以及葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系試管薯的生理指標較對照都有所變化，淀粉含量與對照相比，提高了4.29%～34.27%，其中ARF基因干擾較大的株系Z-11和Z-12的淀粉含量較對照分別提高了25.47%和34.27%，干擾較小的株系Z-2和Z-7的淀粉含量較對照分別提高了4.29%和13.62%，此結(jié)果表明ARF基因的干擾表達程度與淀粉含量的增加幅度呈正相關(guān)，說明ARF基因在馬鈴薯淀粉合成途徑中起著重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)基因株系蛋白質(zhì)含量與對照相比，僅有株系Z-2、Z-7、Z-11提高了1.47%~7.35%，其余株系的蛋白質(zhì)含量均有所下降，說明ARF基因在馬鈴薯蛋白質(zhì)合成中沒有作為主要的調(diào)控因子。轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖含量與對照相比提高了1.44%～17.39%，說明ARF基因的抑制表達對可溶性糖的合成具有正向調(diào)控作用。轉(zhuǎn)基因植株葡萄糖含量比對照降低了6.06%～21.21%，方差分析其較對照均達到極顯著的水平。而轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖含量較對照發(fā)生了較大的變化，比對照提高了11.53%～53.84%，該結(jié)果表明，ARF基因可能作為蔗糖合成過程中的一個負調(diào)控因子，對蔗糖的合成具有較大的影響。Zuk等[18]推測ARF基因的抑制表達導致14-3-3蛋白基因的激活，其中14-3-3蛋白基因?qū)ο跛徇€原酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性有一定的影響，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶不可逆的催化蔗糖的水解反應(yīng)并生成葡萄糖和果糖，是植物體糖代謝途徑中重要的酶類之一。馬鈴薯塊莖成熟后碳水化合物的可利用性是維持植株旺盛代謝所必需的[20]。其中淀粉、蔗糖以及葡萄糖作為重要的能量物質(zhì)，為各器官的生命活動提供養(yǎng)分保障，在不同的生理狀態(tài)中都具有重要的作用，而ARF基因的干擾表達會在一定程度上使淀粉含量，蔗糖有所增加，葡萄糖含量降低。ARF基因在馬鈴薯試管薯形成過程中具體的生理功能還有待進一步深入研究。

4結(jié)論

采用農(nóng)桿菌介導法，獲得了ADP核糖基化因子(ARF)干擾基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。用qRT-PCR檢測表明，轉(zhuǎn)化植株中ARF基因表達的干擾程度可高達93.22%。RNA干擾基因的導入導致轉(zhuǎn)基因植株試管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)、蔗糖和葡萄糖含量發(fā)生了一定程度的變化。研究結(jié)果為進一步研究ARF基因在馬鈴薯塊莖中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Genetic transformation using an RNAi vector containing anARFgene in potato and effects on physiological characteristics of microtuber

PEI Ruifang1,2, LIU Ying1,2, LIU Bailin1, ZHANG Ning2, SI Huaijun1,2*, WANG Di1*

1.GansuKeyLaboratoryofCropGeneticandGermplasmEnhancement,GansuProvincialKeyLaboratoryofAridlandCropScience,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:Using potato (Solanum tuberosum) cultivar ‘Gannongshu 2’ as donor, 48 transgenic plants were obtained through an Agrobacterium-mediated transformation method using an RNAi vector containing an ADP-ribosylation factors (ARF) gene. Testing of the transformed plants on a culture media containing kanmycin and PCR assay showed that the AFR gene had been successfully integrated into the potato genome. The analysis of real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) data showed that the ARF gene expression declined to varying degrees in the transgenic plants compared with the controls, and interference degree reached 92.53% and 93.22% in the transgenic lines Z-11 and Z-12, respectively. The starch content of the transgenic plants increased by 4.29%-34.27%, the protein content by 1.47%-7.35%, the soluble sugar content by 1.44%-17.39%, and the sucrose content by 11.53%-53.84% compared with control plants; however, the glucose content of the transgenic plants decreased by 6.06%-21.21% compared with control plants.

Key words:potato; ARF gene; interference vector; transgenic plants; physiological characteristics

*通訊作者

Corresponding author. E-mail:hjsi@gsau.edu.cn，wangd@gsau.edu.cn

作者簡介：裴瑞芳(1990-)，女，甘肅天水人，在讀碩士。E-mail:peirfsmile@163.com

基金項目：甘肅省杰出青年基金項目(1308RJDA011)和國家自然科學基金項目(31160298)資助。

*收稿日期：2014-02-25；改回日期：2014-03-25

DOI：10.11686/cyxb20150216

http://cyxb.lzu.edu.cn

裴瑞芳， 劉英， 劉柏林， 張寧， 司懷軍， 王蒂. 馬鈴薯ARF基因RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化及對其試管薯生理特性的影響. 草業(yè)學報， 2015， 24(2)： 142-147.

Pei R F, Liu Y, Liu B L, Zhang N, Si H J, Wang D. Genetic transformation using an RNAi vector containing anARFgene in potato and effects on physiological characteristics of microtuber. Acta Prataculturae Sinica， 2015， 24(2)： 142-147.