秋水仙素處理對根莖型清水紫花苜蓿抗旱性的影響

李 悅，師尚禮

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

秋水仙素處理對根莖型清水紫花苜蓿抗旱性的影響

李 悅，師尚禮

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用0.05%，0.1%和0.2% 3個濃度秋水仙素對根莖型清水紫花苜蓿種子進行4 h處理，在幼苗3～4葉期進行干旱脅迫，通過測定脅迫0、3、6、9及12 d復水后葉片相對含水量(RWC)、丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)及葉綠素含量，研究不同濃度處理下清水紫花苜蓿對干旱脅迫的適應能力。結果表明：隨著干旱脅迫時間的延長，清水紫花苜蓿葉片RWC及葉綠素含量呈現降低趨勢，且均在0.2%處理下降低最小；而MDA及Pro含量呈不同程度增加，但MDA含量在0.1%處理下積累最少，而Pro含量在0.2%處理下積累最多。同時，對各處理植株的葉片RWC、Pro含量、MDA含量及葉綠素含量4個生理生化指標進行綜合分析，得出不同濃度秋水仙素處理的根莖型清水紫花苜蓿植株抗旱性強弱順序為：0.1%>0.05%>0.2%>CK。

根莖型清水紫花苜蓿；秋水仙素；抗旱性

紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草，因具有葉量大、葉莖比高、粗蛋白含量高、品質好、抗性強等優點，是一種全球性栽培、適應性廣泛、營養價值高、適口性優良的飼料作物。根莖型紫花苜蓿是紫花苜蓿的一個變型，其根頸部較長，形成根莖混雜區，根頸距地表相對較深，并從其根頸區發育出類似根狀的莖，萌發新芽與幼根，出土形成新的植株，是培育放牧型苜蓿的良好材料，具有許多栽培苜蓿所不具有的植物學和生物學特征[1,2]。在我國，苜蓿也是許多農牧區的首選草種[3]。苜蓿產業化進程不斷推進，對農民增加收入和生態環境建設發揮著至關重要的作用[4,5]。但苜蓿是一種相對需水的作物，優質、高產、穩產的獲得與水資源供應和品種抗旱能力強弱存在直接關系[6]。據統計，我國干旱及半干旱地區面積占全國總耕地面積的48%，干旱已成為影響作物產量和品質的主要限制因子[7]，近年來由于環境惡化、氣溫轉暖、水資源缺乏導致各地旱情頻發，抗旱性強的苜蓿品種在生產實踐中得到廣泛應用。因此，系統開展優質抗旱苜蓿品種的篩選及其抗旱性鑒定與評價的研究，對指導我國干旱、半干旱地區苜蓿產業化穩步發展尤為必要，并具有現實意義。

參照植物抗旱性鑒定方法與指標，通過溫室盆栽控水的方式模擬土壤干旱脅迫條件下，測定不同濃度(0.05%，0.1%和0.2%)秋水仙素處理后的根莖型清水紫花苜蓿植株葉片的相對含水量(RWC)、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(PRO)及葉綠素含量，并對4個生理生化指標進行綜合分析，客觀評價各處理根莖型清水紫花苜蓿的抗旱性，旨在為通過秋水仙素誘變獲得的苜蓿新品種的高產栽培提供一定的理論依據與技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與設計

1.1.1 試驗材料 供試品種為甘肅農業大學草業學院育成的國審品種根莖型清水紫花苜蓿，種子由草業生態系統教育部重點實驗室提供。

1.1.2 試驗設計 挑選大小均勻，飽滿的種子用蒸餾水浸泡一段時間，選擇吸脹的種子整齊地擺放在鋪有濾紙的培養皿中(直徑9 cm，80粒/皿)，加入適量蒸餾水，以不能流動為宜，在25 ℃恒溫培養箱進行培養并及時補給水分。待種子露白，分別用濃度為0.05%(T1處理)、0.1%(T2處理)、0.2%(T3處理)的秋水仙素溶液浸泡4 h后放入恒溫培養箱25 ℃繼續培養，以蒸餾水處理作為對照(CK)，每個處理9次重復，待80%的種子發芽后于花盆中進行盆栽(外口徑為30 cm；內口徑為26 cm，高20 cm，每盆50粒，共36盆)，每盆分裝沙土8 kg，每天觀察并每隔兩天澆灌霍格蘭氏(Hoagland’s)營養液，以確保苜蓿苗生長過程所需的氮、磷、鉀等元素。待幼苗長至三到四葉期時開始干旱脅迫，分別于停水當天(0 d)和干旱脅迫第3、6、9 d及第12 d復水后的上午9∶00采樣(同部位的葉片)，并測定其生理生化指標。

1.3 測定項目與方法

1)葉片相對含水量(RWC) 采用稱重法[8]；2)游離脯氨酸(Pro)含量的測定參考鄒琦[8]的方法；3)丙二醛(MDA)含量的測定參考王學奎[9]的方法；4)葉綠素含量的測定采用吸光光度法(根據修正的Arnon公式進行計算)[10]。

1.4 數據分析

ST采用SPSS 17.0對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理后葉片相對含水量變化

逆境條件下植物葉片相對含水量可反映植物的保水能力，是標志植物水分狀況的重要指標[11]。隨著干旱脅迫時間的延長，各濃度秋水仙素處理的葉片相對含水量均呈降低趨勢，且均較對照高。非干旱脅迫下，T3與CK及T1處理的葉片相對含水量均差異顯著(P<0.05)，而其他各處理間差異不顯著。脅迫3 d時，T2與T3處理的葉片相對含水量與對照有顯著差異(P<0.05)，其他處理之間差異不顯著；脅迫6 d時，葉片RWC含量在CK及T1處理下與T2與T3處理有顯著差異(P<0.05)，而其他處理間無顯著差異；脅迫9 d時，各誘變處理的葉片RWC含量均與對照之間差異顯著，與非脅迫條件下相比，RWC含量分別降低了28.08%、26.16%、25.46%、18.96%(表1)。復水后葉片RWC含量恢復，但仍比未脅迫時有較小降幅。結果表明，經不同濃度秋水仙素誘變處理的苜蓿葉片保水力強于對照，且T3處理下葉片相對含水量下降最少。

表1 不同濃度秋水仙素誘變后葉片相對含水量Table1 The RWC contents of leafs induced by different concentrations of colchicine %

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2 不同濃度秋水仙素處理對葉片丙二醛含量的影響

隨著脅迫時間的延長，各處理下葉片的MDA含量都出現不同程度積累。其中，3 d與9 d脅迫下，T2、T3處理的葉片MDA含量與CK、T1處理之間均有顯著差異(P<0.05)，但T2、T3差異不顯著，CK、T1差異顯著(P<0.05)；6 d脅迫下，不同處理之間葉片MDA含量均差異顯著，且均較非脅迫條件下有不同積累；且T2處理的葉片MDA含量增幅均最小，為0.80%(3 d)、4.59%(6 d)7.31%(9 d)；復水后T3處理的葉片MDA含量與對照差異顯著(P<0.05)，并且各處理MDA含量較對照有小幅度增加。說明干旱脅迫對T2處理的植株傷害程度較小(表2)。

表2 不同濃度秋水仙素處理后的葉片丙二醛含量Table2 The MDA contents of leafs induced by different concentrations of colchicine μg/g EW

2.3 不同濃度秋水仙素處理對葉片游離脯氨酸含量的影響

隨著脅迫時間的增加，不同濃度秋水仙素處理下葉片Pro出現不同程度積累，葉片Pro含量在不同濃度不同脅迫時間之間均差異顯著(P<0.05)。干旱脅迫3，6和9 d時，T3處理葉片Pro含量均較非脅迫條件增加幅度最大，分別為52.24%，92.26%和118.61%；復水后各處理葉片Pro含量小于脅迫時的水平，但仍有小幅度積累，且在T3處理增幅最大，為21.55%(圖1)。由此可知，T3處理下的苜蓿葉片內Pro含量積累最多，適應干旱脅迫能力更強。

吉非替尼（gefitinib）是首個選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，自2002年首先在日本上市，現已廣泛用于既往接受過化療或不適于化療的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌的一線治療藥物。間質性肺病（interstitial lung disease，ILD）是其嚴重的不良反應，致死率較高[1]。目前，吉非替尼致ILD死亡的危險因素尚未見報道，現以國內外吉非替尼致ILD個案報道的文獻為基礎，探討該藥致ILD死亡的危險因素，以便于臨床更加安全使用提供參考。

圖1 不同濃度秋水仙素處理后的葉片Pro含量Fig.1 The Pro contents of leafs induced by different concentrations of colchicine

2.4 不同濃度秋水仙素誘變后苜蓿葉片葉綠素含量

不同處理之間葉片葉綠素含量均差異顯著(P<0.05)，且隨脅迫時間的延長，各處理葉片葉綠素含量呈現不同程度降低趨勢(圖2)。其中脅迫9 d時下降程度最大，CK、T1、T2及T3處理葉片葉綠素含量均較非干旱脅迫下降低了25.75%、22.01%、17.47%、17.33%。由此可知，T3處理的葉綠素含量下降最為緩慢，干旱脅迫對其傷害程度也最小。

2.5 秋水仙素各處理下清水苜蓿抗旱性的綜合評價

牧草對干旱環境的適應具有多樣性和復雜性，其抗旱能力強弱也難以用某一通用指標來評價，因此，研究中需要多種指標相結合，綜合分析干旱脅迫對苜蓿抗旱性的影響。以葉片RWC、MDA含量、Pro含量和葉綠素含量4個指標為依據，應用Fuzzy數學中隸屬度函數法[8,12]進行綜合評判，與抗旱性呈正相關的指標RWC、葉綠素、Pro采用以下公式計算。

圖2 不同濃度秋水仙素處理后的葉片葉綠素含量Fig.2 The Chlorophy II contents of leafs induced by different concentrations of colchicine

Fij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

對與抗旱性呈負相關的MDA采用公式計算。

Fij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

3 討論與結論

近年來，國內外學者通過研究報道，牧草在干旱的環境下各生理生化指標如RWC，Pro和MDA含量、葉綠素含量等都會產生相應的變化以適應干旱脅迫。

表3 秋水仙素不同濃度處理的苜蓿各指標隸屬函數值及綜合評價值Table3 The subordinate function values and comprehensive evaluaticm values of different colchicines concentration treatment to alfalfa

RWC是反映植物抗旱性強弱的一項重要指標，可以有效地保持葉綠體的結構和PsⅡ功能，使植物進行有效的光合作用[13]。RWC越大，下降速率越小，則抗旱性越強。李崇巍等[14]研究表明，能維持較高相對含水量的植物，其抗旱能力亦較強。蒲光蘭等[15]試驗得知，杏(Prunusarmeniaca)在水分脅迫初期，RWC下降較緩；脅迫至末期，下降速率開始加快，隨脅迫增加，凈光合速率出現負值，不再積累光合產物，反而呈消耗代謝，生長停滯。試驗結果表明：隨著脅迫時間的延長，各處理葉片RWC呈下降趨勢，其中T3處理下的RWC降低最小。

MDA作為膜脂過氧化的最終分解產物對細胞膜起傷害作用[16]，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，即膜脂過氧化程度隨品種抗旱性下降而加劇[17]，因此，MDA積累量的高低能夠在一定程度上反應出植物體受干旱脅迫后自身的受損害程度，即對干旱脅迫的承受能力。試驗表明：隨著干旱脅迫程度的加劇，各處理葉片MDA產生不同程度積累。其中以T2處理下MDA含量增加最少，說明干旱脅迫對植株傷害程度較小。

Pro是植物體內重要的滲透調節物質之一，其含量的變化是植物對逆境條件的一種適應性變化[18]。當植物受到逆境脅迫時，尤其是干旱時造成體內脯氨酸積累。抗旱性強的植物Pro積累時間長，積累量也較大[17-19]。試驗結果表明，隨著脅迫時間的增加不同濃度秋水仙素處理的葉片Pro含量出現不同程度積累，其中以T3處理下葉片內Pro含量積累最多，說明處理植株適應干旱脅迫能力較強。

干旱脅迫下葉片葉綠素含量隨著脅迫強度的增大而降低，缺水不僅影響葉綠素的生物合成，而且促進已形成的葉綠素的加速分解，導致葉片發黃，在一定范圍內葉綠素含量高低則直接影響葉片的光合作用能力，從而影響作物產量[20]。試驗顯示，隨著脅迫時間的延長，不同濃度秋水仙素處理使葉片葉綠素含量出現不同程度降低，其中，脅迫9 d時下降程度最大，T3處理的植株葉片葉綠素含量下降最為緩慢，說明干旱脅迫對其傷害程度也最小。

植物抗旱性是一個受多種因素影響的復雜數量性狀，不同植物對某一具體指標的抗旱性反應不一定相同，其評價方法很多，其中，隸屬函數分析提供了1條在多指標測定基礎上對苜蓿抗旱性進行綜合評價的途徑，避免了單一指標的片面性。因此，試驗運用Fuzzy數學隸屬函數綜合評判法[6,10]，對各誘變處理苜蓿的葉片RWC、Pro、MDA含量及葉綠素含量4個生理生化指標進行綜合分析，得出不同濃度秋水仙素處理的清水紫花苜蓿植株抗旱性強弱順序為：T2>T1>T3>CK。說明，經過不同濃度秋水仙素處理的植株抗旱性整體較對照植株有所增強，為今后利用秋水仙素為化學誘變劑對清水紫花苜蓿品種進行誘變加倍育種，獲得抗性更強的新品種奠定了一定的基礎。

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The preliminary research of different colchicine concentration treatments on the drought resistance of RhizomatousMedicagosativacv.Qingshui

LI Yue,SHI Shang-li

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainabilityLanzhou730070)

This paper used four treatments of different concentrations of colchicine(0.05%、0.1%、0.2%) to treat seeds of Medicago sativa cv.Qingshui for 4 hours and conducted drought stress when the seedlings was in 3～4 leaf stage.The contents of RWC,MDA,PRO and Chlorophyll in leaves under drought stress were measured on 0 d、3 d、6 d、9 d and rewater after 12 d.The results showed that the contents of RWC,and Chlorophyll of plant leaves were decreasing,and the lowest values were in the colchicine with 0.2%;MDA and Pro were increasing.However,MDA had a least accumulation under the treatment with 0.1%,and Pro had a most accumulation under the treatment with 0.2%.Meanwhile,based on the comphensive analyse of RWC,MDA,PRO and Chlorophyll,the rank of colchicine concentrations on the drought resistance of Qingshui alfalfa was: 0.1%>0.05%>0.2%>CK.

RhizomatousMedicagosativacv.Qingshui;Colchicine;drought resistance

2014-12-22；

2015-04-10

農業部牧草種質資源保種項目(NB2130135)資助

李悅(1989-)，女，甘肅會寧人，在讀碩士研究生。 E-mail：807653824@qq.com 師尚禮為通訊作者。

S 541

A

1009-5500(2015)04-0070-05