應用簡便的逆轉錄環介導等溫擴增方法檢測腮腺炎病毒核酸

應用簡便的逆轉錄環介導等溫擴增方法檢測腮腺炎病毒核酸

李宏宇1，王爽2，周劍惠2，陳超2，季尚瑋3*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省疾病預防控制中心；3.吉林大學中日聯誼醫院)

流行性腮腺炎(簡稱腮腺炎)是由腮腺炎病毒(Mumps Virus，MuV)感染引起的急性呼吸道傳染病，經空氣飛沫傳播，全年均可發病,以冬春季高發,人類是該病毒的惟一宿主,好發于兒童和青少年，傳染性僅次于麻疹和水痘，是一種在全球流行的急性傳染病,臨床以腮腺非化膿性腫脹、疼痛伴發熱為主要癥狀。2004-2006年我國的腮腺炎爆發占公共衛生事件的20%左右[1，2]。目前對腮腺炎病毒的檢測分為病原學、血清學和分子生物學[3-6]。傳統的病原學和血清學診斷技術以及目前廣泛應用的核酸診斷技術都有不同程度的欠缺。隨著分子生物學技術的不斷發展,逆轉錄環介導等溫擴增方法RT-LAMP技術的問世[7]，使核酸檢測更加快速、便捷、特異。國內已報道將該方法應用于麻疹病毒及風疹病毒核酸檢測[8，9]，本文應用該方法進行腮腺炎病毒的核酸檢測[10]，獲得滿意結果，現報告如下。

1材料與方法

1.1　腮腺炎病毒株

咽拭子經組織培養后獲得腮腺炎病毒株。

1.2　試劑及儀器

RNA提取采用羅氏公司的自動核酸提取儀及配套試劑盒進行提取。RT-PCR： RNA酶抑制劑、AMV逆轉錄酶、DTT、BSA、TaqDNA聚合酶等RT-PCR所需試劑由日本TAKARA公司生產，PCR儀為ABI公司型號為9700。LAMP： Bst DNA polymerase以及AMV逆轉錄酶由New England Biolabs公司生產。

1.3　方法

1.3.1病毒分離咽拭子標本接種在Vero/SLAM細胞(淋巴信號激活因子轉染的非洲綠猴腎細胞)上，36.5℃培養，當CPE≥75%時收集細胞和培養液。如為陰性，連續觀察3代，每代7-9 d。

1.3.2核酸提取按操作程序及說明書操作，提取后的RNA若不立即使用，可于-80℃保存備用。

參考文獻1.3.3RT-PCR引物序列、操作程序見[11]。

1.3.4LAMP的反應體系和條件

(1)配置2倍濃度反應液(1.0 ml)dNTP(10 mmol/L)0.28 ml,10×Bst Buffer 0.2 ml,MgSO4(0.1 mol/l)0.12 ml，Betain(4 mol/L)0.4 ml。

(2)配置引物混合液(120 μl)BIP(100 μmol/L)8 μl,FIP(100 μmol/L)8 μl,B3(100 μmol/L)1 μl,F3(100 μmol/L)1 μl,Bloop(100 μmol/L)4 μl,Floop(100 μmol/L)4 μl,DDW94 μl。

(3)反應體系(25 μl)反應混合液12.5 μl,引物混合液6 μl，BST(8 000 U/ml)1 μl,AMV(5 U/μl)0.1 μl,RNA5 μl,DDW0.4 μl。

(4)反應條件將反應體系于水浴鍋中63℃(±0.5℃)水浴1 h，得到LAMP產物。

1.4　LAMP引物序列及酶切位點

在LAMP反應產物中，每形成一個啞鈴狀莖環結構，都有腮腺炎病毒特異性酶切位點GTGCAC，因此使用內切酶對LAMP產物進行特異性酶切，電泳后根據是否獲得酶切后的單一條帶來證實腮腺炎病毒核酸。

1.5　LAMP產物酶切鑒定及電泳

酶切按10.5 μl體系進行鑒定。取LAMP產物0.5 μl、ALw44 I 內切酶1.0 μl、10×Buffer 1.0 μl以及DDW8 μl。對照管取LAMP產物0.5 μl、DDW 10 μl。37℃(±0.5℃)水浴1 h。使用1.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結果。

2結果

2.1　病毒分離結果

對23份咽拭子進行病毒分離，均未觀察到CPE，需進行病毒核酸檢測。

2.2　腮腺炎病毒LAMP擴增產物及其酶切鑒定結果

圖1所顯示的標記為“1、2”的是腮腺炎病毒株，經RT-PCR證實腮腺炎病毒核酸陽性，經LAMP方法擴增、酶切、電泳后出現典型的LAMP梯狀條帶(圖1 A道 )，但經特異的限制性內切酶ALw44 I酶切后只呈現出單一的條帶(圖1 B道)。

M：DL-2000 DNA分子量對照；1～2：腮腺炎病毒株；3：腮腺炎疫苗株；4：陰性對照A： LAMP 產物梯形圖譜； B：酶切后的LAMP單一條帶

圖1LAMP電泳條帶

2.3　腮腺炎病毒核酸RT-PCR與RT-LAMP檢測比較

因23份標本的病毒分離均為陰性，故分別利用RT-LAMP和RT-PCR兩種方法進行腮腺炎病毒核酸檢測，檢測結果一致，陽性率均為30.4%(7/23)。

3討論

腮腺炎病毒感染的診斷主要依靠臨床診斷和實驗室診斷。臨床診斷依據以是否觀察到腮腺腫大，而對于不典型腮腺炎患者仍需要進行實驗室診斷。實驗室診斷通常采用病毒分離和血清學檢測的方法，病毒分離的時效性依毒株效價的強弱，且并非全部觀察到CPE，故需進行進一步核酸鑒定；血清學通常以間隔28 d采集前后兩份血清，血清IgG抗體呈4倍(或4倍以上)增高的方法進行鑒定，其耗時長、且28 d后第二份標本難采集；急性期腮腺炎患者亦可采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中IgM，但即使腮腺腫大，3 d內采集的血清IgM檢測仍存在陰性的可能[5]。目前RT-PCR 方法被廣泛應用于腮腺炎病毒核酸檢測[3,5,6],其靈敏度高、特異性強，但該方法須使用PCR儀。Nakayama等建立了腮腺炎病毒核酸的LAMP檢測方法[10]，結合Mori等[12]研制出的專門用于LAMP產物檢測的實時監控濁度儀對該方法進行了敏感性和特異性證明。由于該濁度儀目前尚無法在國內購得，故本實驗對LAMP產物采用酶切加電泳的方法，先用特異的限制性內切酶對LAMP產物進行酶切，后根據酶切后的電泳條帶是否單一進行鑒定，結果令人滿意。

RT-LAMP方法易操作，且敏感、特異，特別適用于基層單位進行首發病例的快速診斷，該方法為腮腺炎病毒的快速檢測提供了一種新的手段。

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收稿日期：(2013-12-25)

文章編號：1007-4287(2015)04-0555-02

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