Noggin基因修飾神經干細胞移植對局灶性腦缺血的研究

吳成吉，晉學飛，王　璇，魏春杰，鄒春穎*，張曉梅，董淑欣

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 神經四科，黑龍江 佳木斯154000；2.吉林大學中日聯誼醫院 泌尿外科，吉林 長春130000)

Noggin基因修飾神經干細胞移植對局灶性腦缺血的研究

吳成吉1，晉學飛2，王璇1，魏春杰1，鄒春穎1*，張曉梅1，董淑欣1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 神經四科，黑龍江 佳木斯154000；2.吉林大學中日聯誼醫院 泌尿外科，吉林 長春130000)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0540)

神經干細胞(NSCs)作為神經組織生長發育及損傷修復的細胞學基礎，在中樞神經系統疾病的診治中受到廣泛關注。研究已證實腦內移植神經干細胞可對中樞神經系統損傷起到有效修復作用,然而單純的神經干細胞移植在復雜的神經系統疾病中的療效欠佳，近年來神經干細胞移植與基因治療聯合應用于中樞神經系統疾病逐漸成為新的研究方向。本研究通過將Noggin基因修飾的神經干細胞移植入大腦中動脈梗塞大鼠腦組織，探討其在局灶性腦缺血治療上的功效。

1材料與方法

1.1材料清潔級雄性SD大鼠50只，質量(240±20)g。Neurobasal培養液、5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)購自Gibco公司，鼠抗BrdU單抗、羊抗鼠IgG-FITC購自上海生工生物工程有限公司、鼠立體定向儀購自德國KOPF公司。

1.2實驗方法

1.2.1神經干細胞的分離培養取新生SD胎鼠腦組織經D-Hanks液漂洗，充分剪碎，反復用吸管吹打，經濾過網制成單細胞懸液，接種于Neurobasal培養液，接種密度為1×106個/ml，置于含5%CO2、37℃培養箱中，每3 d半量換液，每7 d傳代一次。

1.2.2大鼠大腦中動脈梗塞(MCAO)模型的建立對SD大鼠行10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，取頸正中切口暴露右側頸總動脈及頸內、外動脈。遠心端結扎頸外動脈，其近端置入4-0尼龍線經頸內動脈阻斷右側大腦中動脈2 h，拔除尼龍線縫合皮膚。模型建立后給予20 kU慶大霉素腹腔內注射。

1.2.3動物分組及移植前神經損害程度評分(NSS)建立MCAO模型后3 d，依照NSS量表12項指標對所有大鼠進行NSS評分，功能完全正常記為0分,功能完全喪失記為16分。每只大鼠評分兩次取平均值。隨機數表法分成3組，其中對照組10只，神經干細胞移植組、Noggin-神經干細胞移植組各20只。

1.2.4神經干細胞的標志和移植以10 μmol/L的BrdU標記神經干細胞及Noggin-神經干細胞，若形成神經球則再次分離吹打，離心并去上清液。建立模型后3 d，用鼠立體定向儀固定MCAO大鼠，常規消毒后取頭皮正中切口，選取前囟近尾端0.8 mm，正中線旁1.2 mm，深度3.0 mm處為側腦室移植點，經微量注射器分別緩慢注入對照組10 μL PBS，神經干細胞移植組注入10 μL空白神經干細胞懸液，Noggin-神經干細胞移植組注入10 μL經Noggin基因修飾的神經干細胞懸液。

1.2.5移植后神經損害程度評分移植后7 d、14 d、21 d再次按相同方法對各組大鼠進行NSS評分，分值越高表示神經損害程度越嚴重。

1.2.6測定神經干細胞的遷移分布建立模型后25d將各組大鼠經10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，插入灌注針頭并剪開右心耳，注入4℃生理鹽水至流出液澄清繼續灌注200 mL多聚甲醛磷酸鹽緩沖液。斷頭取腦置于此固定液24 h，石蠟包埋，連續切片。免疫組化染色采用SABC-DAB法，常規脫蠟水化、PBS沖洗后滴加封閉液20 min。室溫下滴加鼠抗BrdU單抗1 h，PBS沖洗后滴加羊抗鼠IgG-FITC 20 min，PBS沖洗后滴加SABC顯色試劑。在×400鏡下隨機選取5個互不重疊視野，以胞漿出現棕色為陽性染色細胞，計算每張切片的平均細胞數。

1.3統計學方法采用SPSS 16.0軟件對所有實驗所得數據進行處理，對計數資料用χ2檢驗，對計量資料用t檢驗，組間比較用單因素方差分析，取α=0.05作為檢驗水準。

2結果

2.1神經干細胞體外培養小圓型原代細胞密度均勻地懸浮生長，2 d開始自身克隆并逐漸增大，4 d時部分細胞死亡，存活細胞增殖并聚集成大小不等的球形團塊。7 d時已形成邊界清晰、折光性良好的神經球。原代培養7 d后再次機械分離神經球，制成單細胞懸液繼續傳代，細胞健康飽滿，狀態良好。

2.2移植前后各組大鼠神經損害程度評分對照組(7.9±1.5)分，神經干細胞移植組(8.1±1.3)分，Noggin-神經干細胞移植組(8.0±1.2)分，各組差異無統計學意義(F=2.58，P>0.05)。細胞移植后各組NSS評分均呈下降趨勢，Noggin-神經干細胞移植組評分較對照組及神經干細胞移植組低，第7 d顯著低于對照組，第14 d、21 d顯著低于對照組及神經干細胞移植組，差異具有統計學意義(F=5.27，P<0.05)(表1)。

表1　移植后各組大鼠神經損害程度評分

注：與對照組相比*P<0.05；與神經干細胞移植組相比△P<0.05

2.3測定神經干細胞的遷移分布神經干細胞移植組和Noggin-神經干細胞移植組見棕色BrdU陽性細胞以移植點為中心向四周分布。Noggin-神經干細胞移植組可見大量存活移植細胞，分布范圍較神經干細胞移植組廣泛，并向缺血區域周邊組織遷移。BrdU陽性細胞計數Noggin-神經干細胞移植組(126.8±5.46)個/HP，多于神經干細胞移植組(85.5±4.7)個/HP，差異具有統計學意義(F=4.35，P<0.05)。神經干細胞移植組BrdU陽性細胞主要聚集于移植區域，少量移植細胞穿過胼胝體移向健側。移植細胞與受體組織未見明顯排異反應，組織相容性較好。

3討論

神經干細胞在體內自我更新和維持，具有多向分化性，使其攜帶的基因在體內長期存在及表達，且具有方便取材、克隆培養、易于保存及移植等優點，因而成為基因治療的理想載體靶細胞[1]。神經元軸突或胞體受損常導致神經元退化甚至死亡,造成永久性的中樞神經系統功能障礙。損傷誘導局部組織或全腦產生多種細胞因子，促進神經營養因子分泌、血管及星型膠質細胞增生、抑制興奮性氨基酸的毒性作用等起到神經保護及損傷修復作用[2,3]。神經干細胞攜帶目的基因移植到靶組織后表達目的基因，生成細胞因子等生物活性物質誘導干細胞生長分化，發揮細胞替代、組織重建的作用[4]。近年來，5-溴脫氧尿嘧啶核苷以逐漸代替3H-胸腺嘧啶標記細胞，成為研究神經元發生的新標記物。BrdU與3H-胸腺嘧啶都能夠整合入處于S期的細胞，進而標記前體細胞與增殖細胞。BrdU較3H-胸腺嘧啶標記法的優越性在于其非放射性標記的性質，可以用免疫組化法觀測結果[5]。

Noggin基因最早分離自非洲爪蟾的胚胎，是調控成體神經干細胞分化的一種胚胎蛋白。參與機體胚胎組織發育、神經系統成熟、關節軟骨形成及毛發生長等過程，在缺血腦組織可通過抑制骨形態發生蛋白BMPs發揮內源性神經誘導作用[6]。研究表明，BMPs信號可誘導神經干細胞分化為膠質細胞從而抑制神經元生成，Noggin基因表達產物與BMP2/BMP4具有高親和性，阻滯BMP2/BMP4與相應受體的結合，封閉BMPs信號因而可抑制神經干細胞向膠質細胞分化，促進神經元的發生[7,8]。Noggin可誘導胚胎干細胞分化為神經元細胞，促進神經干細胞的增殖和分化，還可提供神經元發生的有利環境，為神經元的生長提供支持。維持神經干細胞生成與分化為神經膠質細胞間的平衡，調控學習和記憶過程[9]。Noggin基因在中樞神經系統中發揮多重功效，被認為在中樞神經系統損傷的治療領域具有研究價值及應用前景。在缺血區移植Noggin基因修飾的神經干細胞能夠促進缺血損傷區微管結合蛋白及生長相關蛋白的表達，增強植入的神經干細胞功效。研究顯示，Noggin蛋白可作用于海馬齒狀回顆粒下層及側腦室下區，調控神經前體細胞向特定神經元分化，用反義寡核苷酸封閉內源性Noggin基因可顯著減少上述區域BrdU陽性反應細胞數量[10]。此項研究中，Noggin-神經干細胞移植組評分第14 d、21 d顯著低于對照組及神經干細胞移植組，表明向大腦中動脈梗塞大鼠腦組織移植攜帶Noggin基因的神經干細胞較之于單純的神經干細胞移植對神經功能損傷的修復具作用更顯著。Noggin-神經干細胞移植組移植細胞分布范圍較廣泛，并向缺血區域周邊組織遷移，提示Noggin基因可有效促進移植細胞的增殖、遷移與分化。Noggin-神經干細胞移植在局灶性腦缺血治療中具有較高臨床意義，為進一步開展神經干細胞移植聯合基因治療的研究提供了參考和方向。

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[8]Sun YR,Zhou LF,Wu X,et al.Prolonged propagation of rat neural stem cells relies on inhibiting autocrine/paracrine bone morphogenetic protein and platelet derived growth factor signals[J].Neural Regeneration Research,2011,10(13):124.

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摘要：目的探討Noggin基因修飾的神經干細胞移植到大鼠局灶性腦缺血處的遷移、分化及對神經功能損傷的修復作用。方法選取SD大鼠50只建立大腦中動脈梗塞模型，隨機分為對照組10只，神經干細胞移植組、Noggin-神經干細胞移植組各20只，分別移植入10 μl PBS、BrdU標記神經干細胞及Noggin-神經干細胞。移植前及移植后7 d、14 d、21 d對各組大鼠進行NSS評分。25 d時處死各組大鼠，腦組織免疫組化染色觀察植入細胞的存活及分布情況。結果移植后各組NSS評分均下降，Noggin-神經干細胞移植組評分第14 d、21 d顯著低于對照組及神經干細胞移植組，差異具有統計學意義(P<0.05)。Noggin-神經干細胞移植組BrdU陽性細胞(126.8±5.46)個/HP，多于神經干細胞移植組(85.5±4.7)個/HP，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論Noggin基因能促進神經干細胞在缺血區域的增殖、遷移與分化，對神經功能損傷的修復具有積極作用。

關鍵詞：Noggin基因；神經干細胞； 移植； 腦缺血

Observation of neural stem cells modified by Noggin transplantation for the treatment of focal cerebral ischemia effectWUCheng-ji，JINXue-fei，WANGXuan，etal.(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of transplanting Noggin gene modified neural stem cell migration into rats with focalcerebral ischemia.MethodsEstablished middle cerebral artery occlusion model of 50 rats.Randomly divided them into control group of 10,neural stem cells transplantation group,Noggin- neural stem transplantation cell group with 20 in each group.Transplanted into 10 μL PBS,BrdU labeled neural stem cells and neural stem cells of Noggin. Before and on the 7,21,14 d after the transplantation,record NSS score of the rats. rats were killed on the 25 d,and observe the survival and distribution of transplanted cells.ResultsNSS score were decreased fter transplantation.The 14 d,21 d scores were significantly lower than control group and neural stem cell transplantation group.Noggin- neural stem cell transplantation group had BrdU positive cell (126.8±5.46)/HP,more than neural stem cells transplantation group (85.5±4.7)/HP,all with significant difference (P<0.05). ConclusionNoggin gene can promote the proliferation,migration and differentiation of neural stem cells in the ischemic region,having a positive effect on neurological functional recovery.

Key words:Noggin;neural stem cells;transplantation;cerebral ischemia

收稿日期：(2014-05-17)

作者簡介：吳成吉(1977-)，男，碩士，主治醫師，研究方向：腦血管病的發病機制及其治療與預防。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R743.31

文章編號：1007-4287(2015)04-0540-03 1007-4287(2015)04-0543-04

通訊作者*

基金項目：黑龍江省自然科學基金面上項目(D2007-02)