CTLA-4抗體抑制小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

崔　倪，王建霞，張海英，李祎南，李明月，邢樹(shù)剛，李　偉*,李一雷*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021；

2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院2011級(jí)5年制，吉林 長(zhǎng)春130021)

CTLA-4抗體抑制小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

崔倪1,2，王建霞1，張海英1，李祎南1，李明月1，邢樹(shù)剛1，李偉1*,李一雷1*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021；

2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院2011級(jí)5年制，吉林 長(zhǎng)春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0532)

近年來(lái)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen-4， CTLA-4)已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵生物靶點(diǎn)，對(duì)惡性黑色素瘤的治療具有顯著療效，但對(duì)其它腫瘤的療效尚不確定[1,2]，并且CTLA-4抗體處理后對(duì)體內(nèi)腫瘤血管新生情況的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目擬制備小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，研究CTLA-4單克隆抗體對(duì)小鼠肺癌生長(zhǎng)的影響，觀察腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)及血管新生情況。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及腫瘤細(xì)胞系C57BL/6雄性小鼠，6-8周齡，體重18-22 g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系來(lái)自吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞置于5% CO2，37℃孵箱中，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2藥物及主要試劑小鼠抗CTLA-4單克隆抗體9H10(Bioxcel公司，美國(guó))，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen， 美國(guó))，兔抗鼠CD4抗體、兔抗鼠CD8抗體、兔抗鼠CD34抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB發(fā)色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.3小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的制備小鼠Lewis肺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代2-3次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清,加0.9%的生理鹽水懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106/ml，接種于小鼠右側(cè)后背部皮下，每只注射0.1 ml。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥將建立移植瘤的小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組在接種腫瘤當(dāng)天(D0)開(kāi)始注射CTLA-4抗體9H10，抗體腹膜內(nèi)注射，劑量100 μg/只，每3天注射2個(gè)50 μg，至第21天。對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。

1.5移植瘤平均體積、重量及腫瘤抑制率檢測(cè)治療開(kāi)始日為第1天，每3天測(cè)量腫瘤的最大直徑(a)和最大橫徑(b)并計(jì)算體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。共治療21天，治療結(jié)束后第2天首先采用摘眼球取血法取小鼠外周血，再采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，取出脾，腫瘤測(cè)量體積，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。腫瘤體積(V)=a×b2/2；腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。

1.6標(biāo)本處理與免疫組織化學(xué)染色腫瘤組織及脾置10%中性福爾馬林緩沖液固定，經(jīng)脫水、浸蠟及包埋后，切3 μm厚切片。用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，加封閉液后，滴加一抗4℃過(guò)夜，次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，ABC法顯色，顯微鏡下觀察到棕黃色即放入自來(lái)水中終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-3分鐘，固定后光鏡下觀察并拍照。

1.7結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Olympus顯微鏡成像系統(tǒng)，DP73照相機(jī)采圖，鏡下避開(kāi)中間因血液供應(yīng)不足而造成的壞死明顯部位及其邊緣，在腫瘤周?chē)L(zhǎng)旺盛的部位采圖，每張切片采集5個(gè)視野，雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)。CD4及CD8陽(yáng)性顆粒主要定位于淋巴細(xì)胞膜，以淋巴細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。CD34陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色。在低倍鏡下尋找血管密集的部位采圖，每張切片采集5個(gè)視野，雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)，單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞、獨(dú)立陽(yáng)性小細(xì)胞團(tuán)或者一個(gè)小管腔計(jì)為一個(gè)血管。MVD = CD34陽(yáng)性管腔數(shù)均值。

2結(jié)果

2.1C57 荷Lewis肺癌小鼠生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析移植瘤接種3天后，荷瘤小鼠開(kāi)始出現(xiàn)腫瘤，空白對(duì)照組小鼠的腫瘤體積隨時(shí)間逐漸增大，局部呈結(jié)節(jié)狀。按照J(rèn)P.Allison文獻(xiàn)里報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤體積≥1cm3記為死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比較，應(yīng)用anti-CTLA-4組可以延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間(圖1)。

將1×106個(gè)細(xì)胞注入小鼠后背部皮下，接種第3天開(kāi)始用藥，直到用藥到21天，用藥期間測(cè)量腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

圖1荷瘤小鼠生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2CTLA-4抗體對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾組織中CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞表達(dá)的影響為了明確CTLA-4抗體對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠細(xì)胞免疫能力的影響，于用藥21天后，處死小鼠取脾組織，用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟中CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的數(shù)量分別為(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，與對(duì)照組比較，應(yīng)用CTLA-4抗體處理后CD4表達(dá)陽(yáng)性率顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2-1，2-2)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中CD8表達(dá)的陽(yáng)性率分別為17.25±2.86和11.32±0.71，與對(duì)照組比較，應(yīng)用CTLA-4抗體處理后CD8表達(dá)的陽(yáng)性率明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3-1,3-2)。

CD4主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞的胞膜。A：對(duì)照組；B：CTLA-4抗體組。

圖2-1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)荷瘤小鼠脾組織中CD4的表達(dá)(SP法.x400)圖2-2CTLA-4抗體對(duì)荷瘤小鼠脾組織

內(nèi)CD4表達(dá)陽(yáng)性率的影響

2.3CTLA-4抗體對(duì)荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中微血管密度的影響為了檢測(cè)CTLA-4抗體對(duì)腫瘤微環(huán)境中血管新生情況的影響，我們用抗CD34單克隆抗體標(biāo)記腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)腫瘤間質(zhì)微血管密度(MVD)值。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組MVD為75.72±14.49，CTLA-4抗體組MVD為37.20±2.84，與空白對(duì)照組比較，CTLA-4抗體處理后，腫瘤MVD值明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(圖4-1，4-2 )。

CD8主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞的胞膜。A：對(duì)照組；B：CTLA-4抗體組。

圖3-1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)荷瘤小鼠脾組織中CD8的表達(dá)(SP法.x400)圖3-2CTLA-4抗體對(duì)荷瘤小鼠脾組織

內(nèi)CD8表達(dá)陽(yáng)性率的影響

A：對(duì)照組；B：CTLA-4抗體組

圖4-1荷瘤小鼠脾組織中CD34的表達(dá)。(SP法.x200)圖4-2CTLA-4抗體對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織

內(nèi)微血管密度的影響

3討論

細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原(CytotoxicTlymphocyteantigen，CTLA-4)是白細(xì)胞表面的跨膜蛋白CD152，在機(jī)體的免疫調(diào)控中，這些分子競(jìng)爭(zhēng)性地與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合，阻礙T細(xì)胞活化，對(duì)免疫起負(fù)調(diào)控作用[3,4]。在腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤間質(zhì)中大量聚集的免疫細(xì)胞表面的CTLA-4及其相應(yīng)的受體表達(dá)上調(diào)，使免疫細(xì)胞處于失活狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視[5,6]。近年來(lái)CTLA-4已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵生物靶點(diǎn)，抗CTLA-4抗體目前已被美國(guó)食物與藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為治療惡性黑色素瘤的臨床用藥，但對(duì)其它腫瘤的療效尚不確定，并且CTLA-4抗體治療后對(duì)體內(nèi)腫瘤血管新生情況的影響尚未見(jiàn)報(bào)道[1，2，7,8]。

本實(shí)驗(yàn)制備小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，進(jìn)而應(yīng)用CTLA-4單克隆抗體檢測(cè)對(duì)小鼠肺癌生長(zhǎng)的影響，觀察腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)及血管新生情況，為進(jìn)一步揭示腫瘤血管新生與免疫抑制之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果顯示，應(yīng)用CTLA-4抗體可延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。CTLA-4抗體處理21天后，取荷瘤小鼠脾臟，監(jiān)測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，應(yīng)用CTLA-4抗體處理后，荷瘤小鼠脾組織中CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞均明顯增多。其可能機(jī)制為：抗CTLA-4抗體阻斷了腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞表面的CTLA-4-B7信號(hào)傳導(dǎo)通路，有效地阻斷了抑制性信號(hào)的活化，同時(shí)提高腫瘤浸潤(rùn)性CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的數(shù)量及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[9]。CD8陽(yáng)性T細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，在細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[10,11]。CD4T細(xì)胞分為輔助性T細(xì)胞(Thcells)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregcells)，其中Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，可以協(xié)同激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，Th2則介導(dǎo)體液免疫，主要激活B細(xì)胞，Treg細(xì)胞為抑制性T細(xì)胞[12,13]。本研究中CTLA-4抗體處理后CD4陽(yáng)性T細(xì)胞百分比增高，其中輔助性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例以及它們?cè)诳鼓[瘤免疫中的作用有待于進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)證實(shí)。

腫瘤生長(zhǎng)到幾個(gè)立方毫米時(shí)處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)及VEGF等細(xì)胞因子促進(jìn)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，Treg細(xì)胞可釋放VEGF等，誘導(dǎo)血管生成，還可通過(guò)分泌細(xì)胞因子，如IL-6、IL-17等，激活stat3轉(zhuǎn)錄因子，間接誘導(dǎo)腫瘤血管新生[14,15]。腫瘤間質(zhì)內(nèi)的新生血管可以為腫瘤生長(zhǎng)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且有助于免疫抑制細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境聚集[16]。因此，腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制和促進(jìn)血管新生之間形成了一個(gè)相互誘導(dǎo)的有利于腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究中，我們采用免疫組化染色標(biāo)記荷瘤組織微環(huán)境中微血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算腫瘤微血管密度(MVD)值，結(jié)果顯示經(jīng)CTLA-4抗體治療后，荷瘤小鼠Lewis肺癌間質(zhì)中的MVD顯著降低。由此可見(jiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞處于失活抑制狀態(tài)，免疫抑制細(xì)胞釋放的炎癥因子誘導(dǎo)腫瘤血管生成，新生的血管又為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的條件[6]。抗CTLA-4抗體不但能夠激發(fā)腫瘤特異性T細(xì)胞繼續(xù)增殖，激活免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用，提高機(jī)體對(duì)抗腫瘤的主動(dòng)免疫作用，同時(shí)也能有效地阻斷腫瘤間質(zhì)的微血管生成[7]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明應(yīng)用抗CTLA-4單克隆抗體可有效地提高荷瘤小鼠Lewis肺癌微環(huán)境中CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)抑制腫瘤間質(zhì)的血管生成。為以CTLA-4為靶點(diǎn)進(jìn)行肺癌的治療研究提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

注：該項(xiàng)目參加了2012年度 吉林大學(xué)“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽。

參考文獻(xiàn)：

[1]GrossoJF,JureMN,KelK,etal.CTLA-4blockadeintumormodels:anoverviewofpreclinicalandtranslationalresearch[J].CancerImmunity,2013,13:5.

[2]KormanAJ,PeggsKS,AllisonJP,etal.Checkpointblockadeincancerimmunotherapy[J].AdvImmunol,2006,90:297.

[3]PeggsKS,QuezadaSA,AllisonJP，etal.CellintrinsicmechanismsofT-cellinhibitionandapplicationtocancertherapy[J].ImmunologicalReviews,2008,224:141.

[4]SmythMJ,DunnGP,SchreibeRD.Cancerimmunosurveillanceandimmunoediting:therolesofimmunityinsuppressingtumordevelopmentandshapingtumorimmunogenicity[J].AdvancesinImmunology,2006,90：1.

[5]CurranMA,MontalvoW,YagitaH，etal.PD-1andCTLA-4combinationblockadeexpandsinfiltratingTcellsandreducesregulatoryTandmyeloidcellswithinB16melanomatumors[J].PNASUSA,2010,107(9):4275.

[6]GrazianiG,TentoriL,NavarraP.Ipilimumab:Anovelimmunostimulatorymonoclonalantibodyforthetreatmentofcancer[J].PharmacologicalResearch,2012,65:9.

[7]TomasiniP,KhobtaN,GreillierL,etal.Ipilimumab:itspotentialinnon-smallcelllungcancer[J].TherAdvMedOncol,2012,4(2):43.

[8]CurranMA,AllisonJP,KimM,etal.CombinationCTLA-4Blockadeand4-1BBActivationEnhancesTumorRejectionbyIncreasingT-CellInfiltration,Proliferation,andCytokineProduction[J].PlosOne,2011,6(4):194.

[9]TuveS,ChenBM,LieberA,etal.CombinationofTumorSite-LocatedCTL-AssociatedAntigen-4BlockadeandSystemicRegulatoryT-CellDepletionInducesTumor-DestructiveImmuneResponses[J].CancerRes,2007,67:5929.

[10]BoissonnasA,FetlerL,ZeelenbergIS.InvivoimagingofcytotoxicTcellinfltrationandeliminationofasolidtumor[J].TheJournalofExperimentalMedicine,2007,204：345.

[11]RudolphM,HebelK,Brunner-WeinzierlMCetal.BlockadeofCTLA-4DecreasestheGenerationofMultifunctionalMemoryCD4+TCellsInVivo[J].JImmunol,2011,186(10):5580.

[12]LindauD,GielenP,KroesenM,etal.Theimmunosuppressivetumournetwork:myeloid-derivedsuppressorcells,regulatoryTcellsandnaturalkillerTcells[J].Immunology,2012,138:105.

[13]Sautès-FridmanC,Cherfils-ViciniJ,DamotteD,etal.Tumormicroenvironmentismultifaceted[J].CancerMetastasisRev，2011,30(1):13.

[14]KimY,StolarskaMA,OthmerHG.Theroleofthemicroenvironmentintumorgrowthandinvasion[J].ProgBiophysMolBiol,2011,106(2):353.

[15]HewVC,TohHCg,AbastadoJ.Immunemicroenvironmentintumorprogression:characteristicsandchallengesfortherapy[J].JournalofOncology,2012,2:1.

[16]EricT,PereH,MaillereB,etal.Angiogenesisandimmunity:abidirectionallinkpotentiallyrelevantforthemonitoringofantiangiogenictherapyandthedevelopmentofnoveltherapeuticcombinationwithimmunotherapy[J].CancerMetastasisRev.2011,30(1):83.

摘要：目的研究抗CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)抗體(9H10)對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用及其機(jī)制。方法選取健康適齡C57小鼠，皮下接種小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系，建立皮下移植瘤模型。12只荷瘤小鼠分為2組，分別為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別腹腔注射給予生理鹽水和CTLA-4抗體(9H10)，通過(guò)腫瘤體積、重量及腫瘤生長(zhǎng)抑制率評(píng)估9H10的抑瘤作用；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脾組織T細(xì)胞亞型(CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞)及腫瘤微血管密度(MVD)，通過(guò)組間對(duì)照分析抗CTLA-4對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞及血管生成的影響。結(jié)果CTLA-4抗體可延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟中CD4及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的數(shù)量分別為(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，與對(duì)照組比較，應(yīng)用抗CTLA-4處理后CD4表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中CD8表達(dá)的陽(yáng)性率分別為17.25±2.86和11.32±0.71，與對(duì)照組比較，應(yīng)用抗CTLA-4處理后CD8表達(dá)的陽(yáng)性率明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用抗CD34單克隆抗體標(biāo)記腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)腫瘤間質(zhì)MVD。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的MVD值分別為37.20±2.84和75.72±14.49， CTLA-4使腫瘤MVD明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論CTLA-4抗體對(duì)荷瘤小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，荷瘤小鼠脾組織中CD4 及CD8表達(dá)均增高，腫瘤間質(zhì)的MVD值顯著降低。CTLA-4在提供機(jī)體抗腫瘤免疫及抑制腫瘤血管生成中均發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：Lewis肺癌；細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)；CD4；CD8；腫瘤血管

Inhibition of Anti-Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 Antibody on the Growth of Lewis Lung CancerCUINi,WANGJian-xia,ZHANGHai-ying,etal.(DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor effects of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antiboby(9H10)on mice Lewis lung cancer.MethodsThe transplantation tumor models were established by injection of Lewis lung cancer cells subcutaneously to C57BL/6 mice.Twelve mice were randomly divided into two groups:The 9H10 therapy group with intraperitoneal injection of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antibody and the control group with the injection of 0.9% sodium chloride respectively.The antitumor effects were investigated by measuring tumor volume,the dynamic change of tumor weight and the inhibition rate of tumor growth.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells in spleen were detected by immunohistochemistry.Microvessel density (MVD) was assessed by CD31 immunostaining.ResultsThe growth rate of tumor bearing mice were delayed and the survival time were prolonged.The CD4 positive T cells in the spleen of tumor bearing mice were 49.05±7.31% and 23.45±8.06% in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD4 T cells were significantly increased comparing with control group after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).The CD8 positive T cells were 17.25±2.86 and 11.32±0.71 in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD8 T cells were significantly increased in the experimental group than in the control group(P<0.05).The tumor interstitial microvessel density (MVD) were 37.20±2.84和75.72±14.49 in the experimental group and control group respectively.The MVD significantly decreased after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).ConclusionThe growth of Lewis lung cancer were inhibited after CTLA-4 antibody treatment.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells were both increased and the MVD value was lowered in the spleen of Lewis cancer bearing mice after CTLA-4 antibody treatment.CTLA-4 may play significant roles both on increasing the tumor immune and inhibiting tumor angiogenesis.

Key words:Lewis lung cancer;CTLA-4;CD4;CD8 Tumor angiogenesis

收稿日期：(2014-05-09)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R734.2

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0532-05

通訊作者*

基金項(xiàng)目:吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(20130102084JC)；吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃資助課題(2013101005)；吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”國(guó)家級(jí)項(xiàng)目資助課題(2013A71249)