4種暖季型草坪草幣斑病病原菌鑒定及其生物學特性

章 武，劉國道，南志標*

（1．蘭州大學草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅蘭州730020；2．中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部熱帶作物種質資源利用重點開放實驗室，海南儋州571737）

4種暖季型草坪草幣斑病病原菌鑒定及其生物學特性

章 武1，劉國道2，南志標1*

（1．蘭州大學草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅蘭州730020；2．中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部熱帶作物種質資源利用重點開放實驗室，海南儋州571737）

2011－2013年對海南省多個高爾夫球場及校園綠化草坪進行調查期間發現一種類似于草坪幣斑病且可嚴重危害4種暖季型草坪草的草坪病害。根據科赫法則驗證、形態學觀察以及ITS序列分析的結果，確定引起海南省幣斑病的病原菌為Sclerotinia homoeocarpa，這是我國首次報道S.homoeocarpa危害雜交狗牙根和地毯草。生物學特性研究表明：S.homoeoparpa生長的適宜溫度為25～30℃，最適溫度為28℃；適宜p H值為4～6，最適p H值為5；菌絲的致死溫度為55℃水浴處理10 min；光照有利于菌絲生長。S.homoeoparpa能夠利用多種碳氮源：碳源測試中，對可溶性淀粉利用率較高，對D-甘露醇和D-阿拉伯糖利用率較低；氮源測試中，病菌對硝酸銨、磷酸二氫銨的利用效果最佳，對脲利用效果最差。

暖季型草坪草；幣斑病；Sclerotinia homoeocarpa；生物學特性

2010年4月，國務院發布了《推進海南國際旅游島建設發展的若干意見》，將海南國際旅游島建設正式上升為國家戰略，賦予了海南合理規范發展高爾夫產業的特殊政策；與此同時，高爾夫重返奧運會，成為2016年奧運會正式比賽項目。環境優美的海南島高爾夫產業正面臨著其他地區所沒有的機遇和政策優勢。然而，隨著海南高爾夫球場數量不斷增加，草坪建植面積的不斷擴大和養護要求的不斷提高，草坪病害防控已成為草坪管理中一個不可忽視的重要問題。

雖然我國草坪病理學的研究基礎相對薄弱，但隨著草坪業的快速發展，我國關于草坪病害的種類和分布的研究也呈現逐年增加的趨勢。截止1994年，南志標和李春杰［1］統計了我國包括草坪草在內的禾本科植物真菌病害1289種，病原真菌391種，其中銹菌146種，黑粉菌65種，半知菌101種，其他真菌75種。多位草坪學者與專家也在全國范圍內的不同地區，不同寄主的草坪病害進行了深入調查研究，詳細記錄了草坪的主要病害種類，危害狀況，分布情況［2-6］，并提出了相對應的綜合防治措施［7-9］。然后，我國對草坪病害的研究尚不十分系統，仍需加強對主要草坪病害病原菌鑒定、生物生理學特性、病害流行學、生態學、遺傳多樣性、病害的防控與預防等方面做出深入系統的研究。

草坪幣斑自1932年由Monteith和Dahl［10］首次在美國發現報道以來，已在北美、中美、歐洲、澳洲、日本和中國等全球各地均有報道。引起草坪幣斑病病原菌是Sclerotinia homoeocarpa。該病害幣斑病得名于其典型的危害癥狀：發病草坪上形成圓形、凹陷、稻草色的約錢幣大小斑塊。幣斑病菌除了可危害禾本科草坪草外，還能侵染石竹科、旋花科、莎草科和豆科在內的500多種植物［11］。直到2010年，該病才首次在我國報道［12-13］。幣斑病可危害我國各地多種草坪草，尤其對高爾夫球場球道、果嶺低修剪草坪危害最嚴重［13］。然而該草坪病害尚未在我國海南省有過報道的記錄。

2011－2013年對海南多家高爾夫球場及校園綠化草坪草病害進行了調查，發現海濱雀稗（Paspalum vaginatum）、雜交狗牙根（Cynodon dactylon×C.transvaalensis）、結縷草（Zoysia spp．）、地毯草（Axonopus compressus）建植的草坪上經常出現圓形或近圓形的直徑為2～15 cm的枯草斑。單株葉片染病時，葉片首先出現水浸狀，而后逐漸擴大形成貫穿整葉的大斑，通常在葉片病斑邊緣會形成一圈紅褐色條帶。該種病害的癥狀與S. homoeoparpa真菌引起的幣斑病癥狀十分相似［14］。為了明確該病害的病原，筆者通過對海濱雀稗、雜交狗牙根、結縷草、地毯草4種暖季型草坪草染病草坪病原菌進行分離鑒定，并對該病原菌的生物學特性進行了研究，為科學防治該草坪病害奠定了基礎。

1 材料與方法

1．1 病原菌的分離和純化

選擇病斑典型的發病海濱雀稗、雜交狗牙根、細葉結縷草（Zoysia tenuifolia）、地毯草葉片沖洗干凈后，在病健交界處剪下3 mm×3 mm的小塊組織，置于2．5%的次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水沖洗3次后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂［PDA，添加慶大霉素（1 m L／L）以抑制細菌生長］培養基上，25℃恒溫培養。病原菌經純化后保存于PDA斜面培養基上，置于4℃冰箱貯存備用。

1．2 分離物回接測定致病性

1．2．1 離體葉片菌餅接種 采取健康且生長均勻的地毯草葉片用自來水沖洗干凈，然后用70%酒精擦洗組織表面，切取長度8 cm的葉片，晾干后置于鋪有無菌濾紙直徑為9 cm的無菌培養皿中，每個分離物接種3枚葉片，即為3個重復。在培養3 d的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，將長有菌絲的一面蓋于葉片上，每片葉片接種2個菌塊，噴灑無菌水保濕，2 d后除去接種的菌絲塊，以接種無菌的培養基塊葉片作為對照，4 d后觀察發病情況。

1．2．2 溫室盆栽菌餅接種 將田間土壤和細沙按5∶5體積混勻滅菌后，分裝在直徑10 cm塑料花盆中，將海濱雀稗、結縷草、狗牙根草籽播種于土壤中，保持濕潤，置于25℃溫室中培養6周后備用。采用5 mm打孔器在培養5 d的菌落邊緣打取菌餅，將菌餅均勻的置于寄主葉片上。每盆盆栽接種10個菌餅，每個分離物接種3盆盆栽，并套袋保濕，以接種不帶菌的培養基塊作為對照，定期觀察發病情況，并進行記錄。

1．3 病原菌鑒定

1．3．1 形態學鑒定 將分離所得病原菌置于25℃條件下黑暗培養。5 d后觀察培養基上各菌落形態，并在光學顯微鏡下觀察菌絲結構特征；20 d后觀察病原菌菌落上子座組織的產生情況，并在光學顯微鏡下觀察其結構特征。

1．3．2 病原菌的分子鑒定 參照White等［15］設計r DNA-ITS區通用引物ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（上海英駿生物技術有限公司合成），以分離自4種草坪草幣斑病病原菌基因組為模板進行PCR擴增，預期產物約580 bp。PCR擴增體系：10×PCR Buffer 5 μL，d NTP Mixture 4μL，20μmol／L引物各1μL，5 U／μL Taq酶0．25μL，模板DNA 1μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應條件：94℃預熱4 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃1 min，共34個循環；72℃延伸5 min。將所有PCR產物分別加入1．0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，經溴化乙錠染色后，于凝膠成像儀檢測，用回收試劑盒回收純化PCR產物。將膠回收產物委托上海英俊生物有限公司進行DNA測序。將分離所得病原菌的ITS序列與Gen-Bank核酸數據庫進行比對，根據病菌的形態特征、培養性狀和致病性，結合序列分析，對病原菌進行鑒定。并用MEGA 5．0進行系統發育分析和進化樹構建，用Neighbor-joining法構建進化樹，自展次數為1000次。

1．4 病原物生物學特性

1．4．1 試驗材料 對分別分離自海濱雀稗、雜交狗牙根、細葉結縷草、地毯草的4個幣斑病菌株ML7-3、TDC-1、HD8-1、HE-1進行生物學特性研究。

1．4．2 溫度對菌絲生長的影響 在生長良好的菌落邊緣用直徑5 mm的打孔器圍繞同心圓打孔，將菌餅接種于PDA平板上，每處理4次重復，置于5，10，15，20，22，25，28，30，35℃9個不同溫度，在黑暗培養箱中培養。48 h后用十字交叉法量取菌落直徑。

1．4．3 p H值對菌絲生長的影響 PDA滅菌之后，在無菌條件下用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl將p H值分別調節至4，5，6，7，8，9，10七個梯度。在生長良好的菌落邊緣用直徑5 mm的打孔器圍繞同心圓打孔，將菌餅分別接種于不同p H值的平板上，每處理4次重復，置于25℃黑暗培養箱中培養。48 h后用十字交叉法量取菌落直徑。

1．4．4 菌絲的致死溫度的測定 在生長良好的菌落邊緣用5 mm打孔器圍繞同心圓打孔，挑取菌餅放入10 m L離心管中，加入1 m L無菌水，分別在35，40，45，50，55，60，65℃的恒溫水浴中處理10 min，以未經水浴處理的菌餅作為對照。將菌餅取出后移至PDA平板培養基上，每皿1個菌餅，每處理4次重復，置于25℃黑暗培養箱中培養。96 h后觀察各菌株的存活狀況。

1．4．5 光照對菌絲生長的影響 將已接種的PDA培養皿分為3組，做如下處理：1）25℃持續光照培養48 h（光照培養箱）；2）25℃持續黑暗培養48 h；3）25℃黑暗12 h與光照12 h交替培養48 h。每個處理重復4次，48 h測量菌落直徑，計算菌落平均生長速度。

1．4．6 碳、氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養液（2．00 g KNO3，1．00 g KH2PO4，0．5 g KCl，0．5 g MgSO4·7 H2O，0．01 g FeSO4，30．0 g蔗糖，1000 m L蒸餾水）為基礎培養液［16］。分別用含相同摩爾質量碳元素的9種不同碳源代替原培養基中的葡萄糖，以不加葡萄糖的培養基作為對照，分別制成含有不同碳源的平板；分別用含相同摩爾質量氮元素的7種不同氮源代替原培養基中的硝酸鉀，以不加氮源的培養基作為對照，分別制成含有不同氮源的平板。在生長良好的海濱雀稗菌株（ML7-3）菌落邊緣用直徑5 mm的打孔器圍繞同心圓打孔，將菌餅分別接種于不同碳、氮源的平板上，每處理4次重復，置于25℃黑暗培養箱中培養。48 h后用十字交叉法量取菌落直徑，計算菌落生長速率。

1．4．7 數據統計與分析 用SAS軟件（Version 9．0）中的方差分析程序，分析溫度、p H值、光照、碳源和氮源對病菌菌絲生長的影響，并用最小顯著差數法（LSD）比較不同處理的差異顯著性（P＜0．05）。

2 結果與分析

2．1 幣斑病的危害癥狀

當草坪修剪較低時，發病草坪有多個圓形、凹陷、漂白色和稻草色小斑塊，2～15 cm大小，如錢幣般。發病嚴重時，相鄰的數個病斑匯合后可形成更大的不規則形狀的病斑。單株植株染病時，由葉尖開始向下枯萎，葉片首先出現水浸狀褪綠斑，隨后葉片變褐枯黃，從葉尖開始由上而下卷曲，病斑邊緣通常會環繞一圈紅褐色條帶，接著整個葉片迅速枯萎死亡。病斑內葉片多同時枯萎形成凹陷的枯草斑，在雨后，或低溫濕潤的天氣，檢查帶有露水的葉片，常常可以觀察到白色、蛛網狀氣生菌絲（圖1A，B，D）。當草坪修剪不夠頻繁或不修剪時，幣斑病菌也可從葉緣和中部侵染葉片，造成從葉片變褐枯萎。在這種情形下，發病草坪并不能形成典型的錢幣狀病斑，這時候診斷就較為困難，但通常葉片的病斑邊緣也會形成一圈紅褐色條帶（圖1C）。

2．2 致病性測定

2．2．1 離體葉片菌餅接種 地毯草離體葉片菌餅接種4 d后，葉片大部分面積變褐枯黃，形成水浸狀褪綠斑，氣生菌絲覆蓋于葉片之上，病斑邊緣有明顯的紅褐色水浸狀條帶。草坪草葉片均表現出與大田草坪上相似的癥狀，并且所有病組織經過分離后均得到了與接種體相同的病原菌（圖2A）。

2．2．2 盆栽菌餅接種 分離物回接海濱雀稗、雜交狗牙根與結縷草盆栽植株的結果表明，該病原真菌導致植株產生與田間癥狀一致的病變：接種2～3 d后可觀察到白色絮狀菌絲散發開來纏繞葉片，接種4～5 d葉片開始出現水浸狀的褪綠斑，接種10 d后葉片枯黃變褐、枯萎死亡，對顯癥植株采用組織分離法進行再分離，所得分離物與接種菌株一致（圖2B，C，D）。

2．3 病原菌鑒定

2．3．1 形態學特征和培養性狀 在PDA培養基上培養首先形成大量向上簇生的、白色絮狀氣生菌絲，25℃黑暗條件下，3～4 d即可長滿一皿；培養7～14 d菌絲集結，菌落逐漸變得致密，部分氣生菌絲開始塌陷。菌落表面逐漸由白色變為淡褐色、淡黃色（圖3A，B）。2～3周后，菌落呈現緊實的墊狀或片狀，菌絲下層產生片狀或墊狀的黑色子座組織。隨著不斷吸收周圍菌絲，子座組織厚度增加，顏色變深（深褐色至黑色），體積增大，最終可占據大部分菌落（圖3C，D）。

2．3．2 病原菌的分子鑒定 對4個幣斑病病原菌菌株ML7-3、TD-C-1、HD8-1、HE-1的r DNA-ITS序列進行擴增后，將PCR產物純化后測序，測序分別獲得580 bp左右的r DNA-ITS序列片段，與期望片段大小相符。本研究已將4個幣斑病病菌r DNA-ITS序列提交到Gen-Bank（登錄號分別為ML7-3：KF048089；TD-C-1：KF048091；HE-1：KF048090；HD8-1：KF048088）。

利用NCBI網站中的BLAST軟件，對所測菌株的序列進行同源性比對：4個菌株與多個幣斑病病原菌S. homoeoparpa的同源性均達到了97%～100%。輔助證明海濱雀稗與結縷草幣斑病主要致病菌是S.homoeoparpa。從構建的系統發育樹可以看出，分離自中國海南省的幣斑病菌株和世界各地的幣斑病聚在同一分類單元，而與三葉草核盤病菌（Sclerotinia trifoliorum）和油菜核盤病菌（Sclerotinia sclerotiorum）不能聚在一個分支，從而證明從海南省分離的菌株是幣斑病病菌（S.homoeoparpa）（圖4）。

2．4 病原物生物學特性

2．4．1 溫度對菌絲生長的影響 由圖5可知，病原菌各菌株菌絲在5～35℃下均能生長，適宜生長溫度為20～30℃，最適生長溫度為28℃，40℃停止生長。

2．4．2 p H值對菌絲生長的影響 各菌株菌絲在p H值為4～10時均可生長，p H值為4～7時各菌株生長狀況較好，其中p H值為5時生長狀況最佳。總體來看，偏酸性的環境條件下有利于菌絲的生長（圖6）。

2．4．3 菌絲致死溫度的測定 35～45℃處理10 min后，各菌落全部生長正常；在50℃處理后，部分菌落不再生長，且能夠生長的菌落生長速率明顯小于低溫處理；55℃處理后，所有菌落均完全停止生長。結果說明，各菌株菌絲的致死溫度均為55℃／10 min（表1）。

2．4．4 光照對菌絲生長的影響 各菌株菌絲在全光照處理下生長最快，在黑暗條件下生長最慢。菌株HD8-1菌絲生長速度在3種處理下差異顯著（P＜0．05）。光照相對于光暗交替更有利于菌絲的生長（表2）。

2．4．5 碳源對菌絲生長的影響 在供試的10種碳源中，以可溶性淀粉為碳源的培養基最適合各菌株生長，其次是以纖維二糖為碳源的培養基。在以D-甘露醇和D-阿拉伯糖為碳源的培養基中生長最慢（圖7）。

2．4．6 氮源對菌絲生長的影響 在供試的8種氮源中，病原菌對硝酸銨、磷酸二氫銨的利用效果最佳，其次是硝酸鉀和蛋白胨。而在含脲的培養基上生長最慢（圖8）。

3 討論

通過對病害癥狀的系統觀察，病菌的形態學、培養性狀和分子特征比較研究以及病原菌致病性測定，結合國內外有關研究資料，結果表明，4種暖季型草坪草海濱雀稗、雜交狗牙根、結縷草、地毯草幣斑病病原均為S.homoeoparpa。

草坪幣斑病在全世界各地都有發生［14，17］，并可嚴重危害禾本科在內的多種植物。在我國，Lv等［12-13］已報道幣斑病可危害我國各地多種草坪草，其中包括海濱雀稗、剪股穎（Agrostis matsumurae）、草地草熟禾（Poa pratensis）、高羊茅（Festuca elata）、結縷草。本研究首次報道幣斑病可危害我國海南省的4種暖季型草坪草，其中幣斑病菌危害雜交狗牙根和地毯草是在我國的首次報道。幣斑病已在我國成為主要的草坪病害之一，因此，幣斑病在我國的分布、寄主范圍、危害程度還有待于進一步的調查研究。

幣斑病的典型癥狀是在草坪上形成約錢幣大小的枯草病斑。然而，筆者發現，在不同的修剪情況下，其癥狀略有不同。在修剪高度較低的高爾夫球場果嶺、球道等草坪上，病斑呈圓形、凹陷、直徑較小的稻草色。而在家用、綠地草坪等留茬較高的草坪上，可形成直徑較大的不規則枯草斑，有時病菌也可從單個葉片的葉緣和中部侵染葉片，造成單個葉片變褐枯萎。當幣斑病危害草坪并未形成典型的幣斑狀病斑時診斷就較為困難，易與紅絲病和褐斑病等草坪病害混淆。但幣斑病菌危害草坪時通常會在葉片病斑邊緣形成環繞一圈紅褐色條帶，這也是幣斑病危害的重要特征之一。

海南省草坪幣斑病病原菌生物學特性的研究表明：病原菌最適生長溫度為28℃，略低于呂晨辰［18］報道的南方幣斑病菌株最適生長溫度31℃［18］。該病原菌對酸堿度的適應能力較強，在p H值為4～10的條件下都能較好的生長，偏酸性的條件有利于菌絲的生長，這與呂晨辰［16］報道的南方菌株最適p H值為5～6基本一致。該菌對供試的10種碳源和8種氮源有一定的選擇性，可溶性淀粉和硝酸銨分別是最佳碳源和最佳氮源，研究還發現，在不加碳源和氮源的培養基中，菌絲雖然能生長，但菌絲稀疏，說明碳源和氮源對草坪幣斑病病菌的生長起著重要的作用。

幣斑病是危害草坪的重要病害，國外已經做了許多關于幣斑病防治的相關研究，其中包括利用優良抗耐病品種［19-21］，配合生態［22-24］和生物防治［25-28］，采取有效的化學防治［29-31］以達到防治效果。我國應借鑒國外研究成果與經驗，根據當地氣候環境條件，制定合理的幣斑防治措施，以實現草坪草幣斑病的綜合治理。

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Identification and characterisation of Sclerotinia homoeoparpa causing leaf blight in 4 warm-season turfgrass species

ZHANG Wu1，LIU Guodao2，NAN Zhibiao1*
1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology；State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China；2.Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Utilization，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China

This paper reports on field disease surveys carried out at several golf courses and college lawns in Hainan Province from 2011 to 2013．A serious disease similar to Dollar Spot was observed which affected 4 common warm-season turfgrass species．Based on comprehensive analyses including Koch’s postulates tests，the identification of morphological characteristics and r DNA－ITS sequencing，the pathogen causing Dollar Spot disease in Hainan province was identified as Sclerotinia homoeocarpa．To our knowledge，this is the first report that S.homoeocarpa can cause Dollar Spot in Burmudagrass and Carpetgrass in China．Biological characteristics analysis showed that S.homoeocarpa grew well in conditions where the temperature ranged from 25－30℃and p H from 5－7．The optimum growth conditions were 28℃and p H 5．Hyphallost their viability in agar plugs that were incubated at 55℃for 10 minutes．Light promoted mycelium growth and all the tested carbon and nitrogen sources were utilized by S.homoeocarpa．Soluble starch had higher usage efficiency for mycelium growth than the other carbon sources，whereas D-mannitol and D-arabinose had lower usage efficien-cy．Ammonium nitrate and ammonium dihydrogen phosphate had higher usage efficiency for mycelium growth than the other nitrogen sources，whereas carbamide had lower usage efficiency．

warm-season turfgrass；Dollar Spot；Sclerotinia homoeocarpa；biological characteristics

10．11686／cyxb20150116 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

章武，劉國道，南志標．4種暖季型草坪草幣斑病病原菌鑒定及其生物學特性．草業學報，2015，24（1）：124-131．

Zhang W，Liu G D，Nan Z B．Identification and characterisation of Sclerotinia homoeoparpa causing leaf blight in 4 warm-season turfgrass species．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：124-131．

2013-05-06；改回日期：2014-03-19

國家公益性行業農業科技專項（201303057）和國家973計劃項目（2014CB138702）資助。

章武（1987-），男，江西撫州人，在讀博士。E-mail：ldzw1987＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：zhibiao＠lzu．edu．cn