不同含水量對溪蓀鳶尾種子保存效果的影響

許 言， 萬宗喆， 方佳楠， 寶力格， 蕭 蕭， 宋 紅， 王 玲， 陳恒利， 彭宏梅， 范麗娟*

(1.東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學帽兒山實驗林場，黑龍江尚志 150611)

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不同含水量對溪蓀鳶尾種子保存效果的影響

許 言1， 萬宗喆1， 方佳楠1， 寶力格1， 蕭 蕭1， 宋 紅1， 王 玲1， 陳恒利2， 彭宏梅2， 范麗娟1*

(1.東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學帽兒山實驗林場，黑龍江尚志 150611)

摘要[目的]研究不同含水量對溪蓀鳶尾種子保存效果的影響。[方法]以寒地特色野生種溪蓀鳶尾種子為材料，通過硅膠干燥法獲得不同含水量的種子，在液氮中保存24 h后，采用水浴化凍、自來水水沖化凍和室溫化凍3種化凍方式，檢測不同條件下種子發(fā)芽率來檢驗保存效果。[結果]種子含水量為5.4%～7.2%時的干燥處理顯著提高了種子發(fā)芽率，但含水量降到3.2%時會降低種子發(fā)芽率；種子含水量為7.2%時超低溫保存后萌發(fā)率會顯著提高，水浴化凍最適。[結論]最佳種子含水量為7.2%，保存后萌發(fā)率高達98.70%。

關鍵詞溪蓀鳶尾；種子；超低溫保存

超低溫保存(cryopreservation)是將植物種質材料經過一定的技術手段處理后，放置到液氮(-196 ℃)中進行保存。在此溫度下，植物材料的物質代謝和生命活動完全停止，并在需要時采用一定的技術方法使材料恢復活力[1-4]，該技術是目前將種質長期保存的有效的生物技術。超低溫保存不受土地、人力等條件的限制，且取材方便、效率高，保證了種質的遺傳穩(wěn)定性，已被較多地應用于園林植物和農作物種質長期保存上[5]。至2010年，全球約740萬份(含重復)植物資源采用超低溫保存技術保存在國際、國家、地區(qū)或私人的基因庫中[6]，其中美國、印度、日本等國建立的植物種質基因庫庫存數(shù)量逐年增多，規(guī)模日益增大。我國作為園林觀賞植物種質資源大國，更應該加大對觀賞植物種質資源的超低溫保存技術研究與應用，尤其對還沒得到充分開發(fā)和利用卻在數(shù)量上不斷減少或消失的種類，采取長期或永久性保存技術研究有著特殊意義。通常種子保存材料的含水量對保存成敗有重要影響。一般認為材料含水量越少，受到的超低溫凍害就越少，但不同種子保存材料都具有一個安全含水量范圍，過度脫水也會對材料造成傷害。所以確定種子適宜的含水量對超低溫保存效果至關重要。

溪蓀鳶尾(Irissanguinea)為鳶尾科鳶尾屬多年生宿根花卉，在我國主要分布于東北地區(qū)，其耐水濕、耐寒，且花型奇特、花色艷麗、株型俊美，有很高的觀賞和應用價值。溪蓀鳶尾是我國少有的耐寒、水陸兩棲的夏季開花的藍色花種類，也是難得的抗寒育種材料。近年來對鳶尾屬溪蓀的研究主要集中在種子生物學[7]、葉表微形態(tài)、葉和根的解剖學[8]、耐陰性[9]、抗旱性[10-11]、種間雜交親和性[12]和生殖生物學方面[13]，而對于種質資源超低溫保存的研究鮮有報道。目前由于生存環(huán)境破壞等原因導致野生溪蓀鳶尾種質資源急劇下降，因此采取適當?shù)谋４娲胧┻M行資源保護是十分必要和迫切的。筆者選擇溪蓀鳶尾種子為試驗材料，通過種子干燥法獲得不同含水量的種子，研究不同含水量種子的超低溫保存效果，進而獲得溪蓀鳶尾種子超低溫保存適宜條件，并進行長期保存，以期為鳶尾屬植物這類觀賞價值較高的種質保存技術的進一步研究奠定基礎。

1材料及方法

1.1供試材料2013年秋季于東北林業(yè)大學實驗基地采集溪蓀鳶尾成熟種子，于室內自然陰干，并置于4 ℃冰箱內貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2研究方法

1.2.1溪蓀鳶尾種子初始含水量測定。種子含水量測定參照通用的《國際種子檢驗規(guī)程》[14]，采用烘干法對種子含水量進行測定。即將去雜種子放在電子天平上稱量試樣4.5～5.0 g，3組重復，種子重量設為a。準備3個鋁盒，放在烘箱內預先烘干直至恒重。將稱好的溪蓀鳶尾種子分別放在3個鋁盒內，稱取總重量b，然后放在(105±2) ℃的烘箱內烘干(17±2) h后，稱重設為c。種子含水量計算公式如下：

種子含水量=(b-c)/a×100%

1.2.2溪蓀鳶尾種子干燥處理。采用硅膠干燥法進行干燥。在恒溫25 ℃條件下，將種子用尼龍網(wǎng)袋包裝后埋入干燥器的硅膠中進行干燥，種子與硅膠重量比為1∶10，干燥器中的硅膠每天需要用經105 ℃充分干燥冷卻后的硅膠進行更換。根據(jù)種子的含水量和脫水速度，每隔一段時間對干燥過程中的種子進行取樣稱重，在達到要求的含水量范圍時取出。干燥后的種子用鋁箔袋密封包裝備用。成熟種子室內自然干燥后的含水量是9.5%(作為對照)，根據(jù)含水量梯度設計需要，取不同含水量的種子作為超低溫保存試驗材料，含水量分別是7.2%、5.4%和3.2%。

1.2.3種子超低溫保存及解凍。將經過適度干燥的溪蓀鳶尾種子裝入1. 8 ml的凍存管中，每個凍存管中裝入的種子量以不超過凍存管容積的2/3為宜，將瓶蓋擰緊，再將裝有種子的凍存管放在凍存管架上分別標記好后投入液氮(-196 ℃)凍存。凍存一段時間后(視具體需要而定，該試驗采用凍存24 h)，將凍存管從液氮中取出，用不同的化凍方法：水浴化凍、自來水水沖化凍和室溫化凍方法解凍，分別是40 ℃水浴5～6 min化凍；18 ℃左右自來水沖洗6～7 min化凍；室溫(25±2)℃中靜置約30 min化凍。不同含水量種子液氮保存后經3種解凍方式處理，其中水浴化凍的解凍速度最快，屬于快速化凍；室溫化凍的速度最慢，屬于慢速化凍；自來水沖洗化凍的速度介于兩者之間。化凍后將種子從凍存管中取出，進行發(fā)芽率檢測。

1.2.4溪蓀鳶尾種子發(fā)芽率測定。將保存前的種子(其中經過干燥處理而未經液氮保存的種子在浸種前需要放在室內條件下回濕24 h)和經液氮保存化凍后的種子采用100 μg/g 6-BA浸種24 h，之后用清水沖洗3遍，放入培養(yǎng)皿在光照培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)。培養(yǎng)皿內要墊上厚度均勻的脫脂棉，其上再墊一層濾紙并用蒸餾水浸透脫脂棉和濾紙，以濾紙表面濕潤而無積水為宜。每個培養(yǎng)皿均勻放置種子50粒，重復3次。光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽條件為：晝夜變溫處理，即30 ℃(8 h)/20 ℃(16 h)，保持培養(yǎng)皿內濾紙的濕潤。以后每天查看種子發(fā)芽情況，從有種子萌芽開始，記錄種子每天的發(fā)芽個數(shù)，直至連續(xù)幾天內無再發(fā)芽種子。發(fā)芽率計算公式如下：

發(fā)芽率=(發(fā)芽的種子數(shù)/供監(jiān)測的種子數(shù))×100%

2結果與分析

2.1不同含水量種子發(fā)芽率的比較以自然干燥的種子為對照，超低溫保存前不同含水量種子的萌發(fā)率有所不同。由表1可知，自然干燥的種子發(fā)芽率是94.70%，含水量為7.2%時的種子發(fā)芽率最高，達到97.40%，與對照差異顯著，與含水量5.4%時的種子發(fā)芽率(96.70%)接近；含水量為3.2%時種子發(fā)芽率最低，為88.70%，與對照差異顯著。由此可見，溪蓀鳶尾種子經由適當?shù)拿撍欣谔岣甙l(fā)芽率，然而過度脫水會導致種子發(fā)芽率降低。

2.2不同解凍方式對不同含水量種子保存后發(fā)芽率的影響由表2可知，不同含水量種子處理后仍能保持88.70%以上的發(fā)芽率，可見溪蓀鳶尾種子具有較高活力和較強的生命力，種子品質比較好。3種解凍方式中水浴化凍對含水量9.5%、7.2%、5.4%的種子化凍效果較好，相對室溫化凍、自來水水沖化凍方式具有較高的發(fā)芽率，說明溪蓀鳶尾種子超低溫儲藏后更適合水浴化凍方法解凍。其中，含水量為7.2%的種子經水浴化凍后的發(fā)芽率高達98.70%，與含水量9.5%種子的發(fā)芽率差異不顯著，與含水量5.4%、3.2%種子的發(fā)芽率差異顯著；含水量為9.5%、7.2%時的種子保存后發(fā)芽率還有所提高；而對于含水量3.2%的種子來說，保存前后發(fā)芽率沒有明顯變化，但較其他含水量種子發(fā)芽率較低，并且差異顯著?？梢娤p鳶尾種子超低溫保存含水量不是越低越好；水浴化凍更適合凍存后種子活力恢復。

表1　不同含水量對溪蓀種子發(fā)芽率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異達顯著水平(P<0.05)。下同。

表2　超低溫保存后不同化凍方式對溪蓀種子發(fā)芽率的影響

3結論與討論

(1)通常保存材料的含水量被認為對保存成敗有重要影響，一般認為材料含水量越少，受到的超低溫凍害就越少，但不同保存材料都具有一個安全含水量范圍，過度脫水也會對材料造成傷害。河英虎[15]研究認為合歡種子在10%的自然含水量下保存于液氮中發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，而青杄種子需經過干燥脫水至含水量為4%時超低溫保存種子萌發(fā)力較好。盧玲[16]研究得出高山栲種子脫水至含水量為20．36%是比較好的超低溫保存含水量條件。該研究中干燥處理在超低溫保存前后對種子的影響不同，含水量在7.2%～9.5%內對種子活力影響不顯著，超低溫保存后活力還會提升，最佳條件是含水量為7.2%，保存后的發(fā)芽率高達98.70%。

(2)理論上認為，超低溫保存后的化凍過程中細胞內的次生結冰會對細胞產生機械損傷，從而降低超低溫保存的成功率[17]。但該研究發(fā)現(xiàn)溪蓀鳶尾種子在含水量為9.5%、7.2%時，超低溫保存后發(fā)芽率有所升高，尤其含水量在7.2%時，發(fā)芽率高達98.70%，這一結果可能與溪蓀鳶尾種子自身的結構特點有關。溪蓀鳶尾主要分布在東亞的北溫帶乃至寒帶，所處地區(qū)冬季極其嚴寒，溫度可達-40 ℃左右，而-30～-50 ℃被認為是冰晶生長和形成的“危險溫度區(qū)”。一般溫度達到-30 ℃附近時，細胞內水分發(fā)生“同核結冰”，即水分子以自身為結晶核形成冰晶，使細胞中水分進入過冷卻狀態(tài)，細胞質濃度越高，過冷卻點越低，而溪蓀鳶尾成熟種子自然含水量就較低，細胞質濃度相對很高，所以對溪蓀鳶尾種子來說，含水量為9.5%、7.2%直接進行超低溫保存效果較好。

(3)化凍方式是影響超低溫保存的關鍵因素之一[18-19]。不同化凍方式處理，在溪蓀鳶尾種子超低溫保存后對其發(fā)芽率有著顯著影響。通過對不同化凍方式的比較分析可以知道，種子的低溫水浴化凍最佳，室溫化凍次之，自來水水沖化凍最次。其中水浴化凍種子萌發(fā)率有所提高，高達98.70%。超低溫保存后的化凍過程中細胞內的次生結冰對細胞會產生機械損傷，從而降低超低溫保存的成功率。一般認為快速化凍對種子發(fā)芽率的影響優(yōu)于慢速化凍，化凍速度由快到慢的化凍方法依次是水浴化凍、自來水水沖化凍、室溫化凍。而溪蓀鳶尾種子在最快化凍速度下(水浴化凍)和最慢化凍速度下(室溫化凍)的發(fā)芽率均優(yōu)于自來水水沖的發(fā)芽率，其原因有待進一步驗證分析。

(4)對溪蓀鳶尾不同含水量種子超低溫保存后不同化凍方式的發(fā)芽率情況的分析可知，溪蓀鳶尾種子超低溫保存條件為溪蓀鳶尾種子在含水量為7.2%～9.5%可直接超低溫保存，保存后萌發(fā)率會有所提高；低溫水浴化凍最佳，含水量為9.5%、7.2%時種子萌發(fā)率分別高達96.60% 、98.70%。超低溫保存技術目前被認為是保存植物材料最有效最理想的方法，在液氮的環(huán)境下，植物材料所有的生命代謝活動幾乎是停止的[20-21]，可以實現(xiàn)永久保持組織培養(yǎng)植物形態(tài)發(fā)生的能力，利于植物種質永續(xù)利用和便于不同地區(qū)間的種質交換。該研究確定了溪蓀鳶尾種子液氮有效長期保存的條件，也為鳶尾屬植物其他種質保存提供了借鑒。

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Effects of Different Water Content on Preservation ofIrissanguineaSeed

XU Yan，WAN Zong-zhe，F(xiàn)ANG Jia-nan，F(xiàn)AN Li-juan*et al( The College of Landscape，Northeast Forestry University, Harbin， Heilongjiang 150040)

Abstract[Objective] To study the effects of different water content on preservation ofIrissanguineaseed.[Method] There is no denying that liquid nitrogen cryopreservation is an ideal way to preserve germplasm for a long time. When using seeds as saving materials, the optimal moisture contents and thawed are very important to the effect of cryopreservation. This study uses the wildIrissanguineaseeds for the experimental materials which are grow in cold places. We get the seeds of different water contents with the method of drying by silica gel, and then seeds were preserved in liquid nitrogen for 24 hours. Using three kinds of defrost modes to test the seed germination rate under different conditions to test effect.[Result]The results showed that seed moisture content was 5.4%-7.2% of dry treatment had significant effect on seed germination rate, but will reduce the seed germination rate under 3.2% moisture content. Seed germination rate can significantly improve after cryopreservation when the moisture content was 7.2%.[Conclusion]The germination rate is as high as 98.70% when the optimum water content is 7.2%.

Key wordsIrissanguinea；Seeds；Cryopreservation

收稿日期2015-11-30

作者簡介許言(1993- )，男，黑龍江哈爾濱人，本科生，專業(yè)：園林。*通訊作者，講師，碩士，從事園林植物種質資源研究。

基金項目大學生國家級創(chuàng)新項目(201410225050)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(2572015BA07)。

中圖分類號S 722.1+7

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)36-230-02