裂谷熱疫苗研究進展

李月濤，鄭學星，王翠玲，王化磊，楊松濤，夏咸柱

裂谷熱（Rift Valley fever,RVF）是由裂谷熱病毒（RiftValley fever virus,RVFV）引起的由節肢動物傳播的一種急性、發熱性人獸共患傳染病。1930年，科學家Danbney等在肯尼亞裂谷的一次綿羊疾病暴發調查中首次分離到RVFV[1]。本病主要流行于非洲反芻動物，可引起懷孕動物流產及新生動物死亡；人類對本病普遍易感，嚴重者可引發死亡。

WHO將RVFV列為生物戰劑之一，美國疾病預防控制中心和農業部將其列為A類病原體[2]，世界動物衛生組織將RVF列為A類法定報告動物疫病，我國《國家中長期動物疫病防治規劃（2012—2020年）》將RVF列入重點防范的13種外來動物疫病。

據報道，1950—1951年肯尼亞暴發RVF疫情，造成10萬只羊死亡，2萬人感染[3]。1977年埃及暴發RVF疫情，25%～50%的羊、牛和駱駝感染，20萬人感染，598人死亡，有些地區感染率高達35%[4]。

值得注意的是，2000年9月RVF越過紅海，首次在傳統疫區以外的地區——阿拉伯半島（沙特阿拉伯和也門）出現疫情，增加了其向亞洲和歐洲其他地區傳播和擴散的威脅[5]。

疫苗可以有效預防動物和人的RVF。本文就RVFV的病原學、流行病學及疫苗最新研究進展進行綜述。

1 病原學

RVFV是一種RNA病毒，屬布尼亞病毒科沙蠅病毒屬，只有1個血清型。RVFV顆粒呈球形，顆粒直徑為80～120 nm。病毒核酸為單股負鏈RNA，囊膜包圍的3個核糖核蛋白復合體對應S、M和L基因組片段。L節段長6404 nt，反向編碼RNA依賴的RNA聚合酶，也稱為L蛋白。M節段長3885 nt，反向編碼1個聚合蛋白，經翻譯后剪切成2個大小分別為78 000 Da和14 000 Da的非結構蛋白（NSm）以及2個糖蛋白（GN和GC）。S節段長度為1690 nt，利用雙向策略，反義鏈編碼核衣殼蛋白（N），正義鏈編碼一個非結構蛋白（NSs）[2]。

RVFV的各個蛋白在病毒復制和致病過程中的作用一直是研究的熱點。N蛋白和L蛋白與病毒基因組結合形成核糖核蛋白復合物，然后進行基因組的轉錄和復制。糖蛋白對于布尼亞病毒在高爾基體內的成熟具有重要作用，GN和GC蛋白參與高爾基體的定位過程。研究表明，GN蛋白C端的48個氨基酸部位就是RVFV的高爾基體定位信號，而GC蛋白則通過物理作用與GN蛋白相結合從而定位于高爾基體。N蛋白是RVFV主要的免疫原，而病毒表面的GN和GC蛋白含有中和表位，均能刺激機體產生抗體，但只有GN能刺激機體產生中和抗體。核衣殼蛋白能刺激機體產生補體結合抗體。研究者利用單克隆抗體定位了GN糖蛋白含有的4個抗原決定簇，其氨基酸序列分別為Ⅰ（105－138aa）、Ⅱ（229－239aa）、Ⅲ（362－375aa）和Ⅳ（127－146aa）。表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ為中和表位，而表位Ⅲ為非中和表位。其中，抗原決定簇Ⅳ與構象有關，蛋白經SDS變性后不能與相應的單克隆抗體Ⅳ反應[6]。

2 流行病學

2.1 傳染源 小綿羊、小山羊和小牛是本病的主要傳染源。急性患者的血液和咽喉部有病毒存在，因此患者和其他動物宿主也可成為本病的傳染源。感染動物的血液、體液、內臟和器官都具有傳染性。

2.2 傳播媒介 RVF主要是由蚊子傳播，已知的可傳播本病的蚊子種類超過20種，伊蚊和庫蚊是本病流行的主要媒介，不同蚊種在不同地區被證明是優勢媒介。RVF能被多種蚊子傳播的特性使其很可能成為世界范圍內重要的人獸共患病，而且綿羊和駱駝一旦感染發生高病毒血癥，會更有效地傳播本病。本病可以通過蚊蟲的卵巢傳播是其另一個關鍵的昆蟲學特征。具有感染性的卵在土壤中能保持休眠狀態幾年，一旦有適合的環境條件，如大量的降雨、發生洪水或修建大壩，可導致蚊卵孵化，大量蚊蟲滋生，新的感染性蚊蟲會導致新一輪RVF的暴發。

2.3 易感對象 RVFV具有很廣的脊椎動物寄生譜，反芻動物綿羊、山羊、牛和駱駝是其主要感染者。其他易感動物包括羚羊、馬、猴、田鼠和野生嚙齒類動物等。不同年齡的動物易感程度和病情不同。羔羊感染RVFV的死亡率可達90%，成年羊的死亡率低于10%，懷孕母羊感染后幾乎100%流產。綿羊是RVFV的擴增宿主和二級傳染源。人對RVFV普遍易感，可通過接觸、處理感染性材料或蚊蟲媒介叮咬感染。其中高危人群包括：①在本病流行地區露宿者；②流行地區的牧民、屠宰工作人員和獸醫以及其他與被感染動物接觸者；③在流行病地區旅游的游客。人感染后，有癥狀的患者表現為肝炎、視網膜炎、發熱，或發展為綜合征，如肝炎、出血熱或腦炎，甚至死亡。本病病死率為1%左右。但近幾次發生的流行中，病死率有上升的趨勢[3]。

2.4 流行特點 本病呈地方性流行或暴發流行。多發于農村和牧區。一般于5月末或6月初開始發病，11月底至12月終止流行。人的發病通常在動物流產和發病后1～2周出現。本病有明顯的職業性，牧民、獸醫、屠夫和農民多見，RVFV研究人員發病率也較高。

3 RVFV疫苗

3.1 滅活疫苗 第1個以人用為目的RVFV的疫苗于1962年由Randall及其同事開發[7]。這種疫苗基于Entebbe毒株，該毒株于1944年從來源于烏干達的蚊子中分離出來。原Entebbe毒株在原代猴腎細胞增殖并通過福爾馬林滅活。疫苗能誘導人體產生中和抗體，個體須多次免疫以達到可檢測到的中和抗體滴度。疫苗效價在4～6℃條件下存儲8個月以上無改變，據報道，1000人以上免疫后無不適的影響[7]。此后，該疫苗由南非國家藥品生物研究公司（NDBR）生產，命名為NDBR－103疫苗，從1967年開始用于保護實驗室工作者。

為提高疫苗生產標準，NDBR－103疫苗毒種被飾板純化，并在二倍體恒河猴細胞上增殖，用于開發新疫苗。新疫苗由政府服務部門（TSI－GSD）和美國軍隊委托索爾克研究所生產，被稱為TSI－GSD 200疫苗。Rusnak等[8]報道了TSI－GSD 200疫苗19年的免疫原性和安全性。結果表明，該疫苗耐受性良好，由于滴度下降均在首次疫苗接種后6～12個月，推薦首次疫苗接種后6個月加強劑量免疫。盡管TSI－GSD 200疫苗對實驗室工作人員的保護非常有價值，但3次基礎免疫和1次加強免疫的要求也表明，有必要研究一個更為有效的人用疫苗。

3.2 弱毒疫苗

3.2.1 Smithburn疫苗 19世紀40年代烏干達學者Smithburn通過RVFV在老鼠腦組織傳代開發了Smithburn疫苗，這是第1個RVFV疫苗。產生的嗜神經Smithburn病毒目前仍在用作獸用疫苗，并且由南非Onderstepoort生物制品公司生產。該疫苗生產成本較低并且免疫接種1次就能產生長期免疫性，因此對流行地區RVFV的控制很有價值。然而，由于疫苗殘余毒力能導致接種的懷孕動物流產和胎兒畸形，因此，Smithburn疫苗從未被考慮用于人類[9]。

3.2.2 Clone 13疫苗 Clone 13病毒株由74HB59毒株的噬斑純化克隆而來，該毒株從中非共和國的一例患者身上分離[10]。該病毒在NSS基因含有大的（70%）缺失，在小鼠中高度衰減。然而Clone 13疫苗不是完全無毒力的，因為一項研究表明16只接種小鼠中有2只出現延遲性神經功能障礙和癱瘓[11]。綿羊[12]和牛[13]接種Clone 13疫苗的安全性和有效性研究表明，無任何不良反應發生，且免疫效力較高。

3.2.3 MP－12疫苗 1985年，Caplen等[14]證明通過連續誘變RVFV開發活的減毒疫苗是一種可行的方法。強毒株ZH548通過在誘變劑5－氟尿嘧啶的存在下不斷傳代，誘變病毒的毒力持續減弱，第12代后收獲，被命名為MVP 12（后被命名為MP－12）。

2003 年，Morrill和 Peters[15]報道了一項 MP－12疫苗在恒河猴的致病性和神經毒性研究。MP－12的靜脈內給藥導致低水平的病毒血癥，并且血清AST和ALT水平出現輕微的短暫升高，而GGT水平保持在正常范圍內。不過，未出現臨床癥狀。為了研究MP－12疫苗潛在神經毒性，分別通過肌內、下丘腦和脊柱內注射的途徑接種猴子。在第1個實驗中，5只猴子中的2只變得感覺過敏并發展成肌肉震顫。在第2個實驗中，23只猴子中的2只出現左或右下癱瘓。綜合2次實驗研究得出結論：MP－12疫苗并非無害，但殘留的病理病變較輕微，在實驗中觀察到的嚴重程度的順序與17 d黃熱病疫苗類似。

Morrill和Peters[16]還用恒河猴對疫苗的有效性進行研究。通過肌內注射接種疫苗并不會造成不良影響，盡管對對照組猴子攻毒未出現臨床癥狀，但免疫避免了病毒血癥的發生。隨后的研究中發現，通過不同黏膜途徑接種疫苗可以防止病毒血癥發生。

對于MP－12疫苗的效力和安全性也進行了人體試驗研究，有63名志愿者參與[17]。研究表明未發生嚴重不良反應，也未發現毒力回歸。

3.3 基因工程疫苗

3.3.1 亞單位和核酸疫苗 Collett和Schmaljohn團隊是最先基于Gn和Gc亞單位疫苗開發的開拓者，他們第一批表達了牛痘病毒和桿狀病毒基因組的單個基因，并且研究了這些蛋白質的免疫原性。近年來，Kortekaas等[18]開發出一種基于Gn胞外結構域（GN－e）的亞單位疫苗，主要的目標是產生中和抗體。該GN－e蛋白與Stimune佐劑配制后在給小鼠和羊羔誘導單次接種后產生中和抗體，并保護羊羔避免出現病毒血癥、發熱和臨床體征。

DNA疫苗的主要優點是容易生產，而免疫原性差是過去幾十年一直困擾的主要問題，隨著技術的提高有望盡快克服這一障礙。控制RVFV的實驗性DNA疫苗已經開發出來，并且在嚙齒類動物模型上獲得了良好的結果。在綿羊上進行了第1個DNA疫苗實驗，雖然實驗結果建議須進一步改進其免疫原性，但也表明這是一個可行的方法。

3.3.2 載體疫苗 在過去的10年中，先后開發評估了幾個人用的基于病毒載體的RVFV疫苗。近年來，基于痘病毒的改良安卡拉牛痘（MVA）疫苗和以痘病毒為基礎的候選疫苗在狒狒上的實驗表明，痘病毒載體疫苗具有安全性和免疫原性[19]。基于甲病毒復制子和復制缺陷型腺病毒載體CAdVax和ChAd－Ox1的試驗性疫苗也已經開發出來。

Kortekaas等[20]開發了一種基于副粘病毒新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）的載體疫苗。單次接種產生的中和抗體保護羔羊未出現病毒血癥和臨床癥狀。這個疫苗被稱為NDV－GnGc，已經開發用于家畜使用，該疫苗良好的免疫原性及安全性特征使其特別適合作為人的候選疫苗。NDV作為疫苗載體應用于人類的潛在用途已被廣泛接受，因為人類不是NDV的天然宿主，最大限度減少了由于載體存在先天性免疫力導致接種失敗的危險性[9]。

3.3.3 病毒樣顆粒（virus－like particles,VLPs）疫苗 VLPs是由某種病毒的一個或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的空心蛋白顆粒。與全病毒相比，VLPs作為疫苗具有獨特優勢：①安全性高，不含病毒核酸，無法自主復制，不存在基因重組或重配和毒力回復的可能；②表面抗原排列高度重復有序；③保持病毒抗原的天然構象，易被機體免疫系統識別；④允許外源蛋白的摻入；⑤能區別動物自然感染與免疫[21]。VLPs憑借本身的大小、電位等性質，能夠有效激活抗原提呈細胞及B淋巴細胞[22－23]，既可通過主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex,MHC）－Ⅱ類分子途徑又可通過MHC－Ⅰ類分子途徑進行加工提呈，從而誘導強烈的體液免疫和細胞免疫[24－26]。這使得在無病毒復制條件下樹突狀細胞能有效地誘導細胞毒性T淋巴細胞反應[27]。因此，某些VLPs既能激活輔助性T淋巴細胞又能激活細胞毒性T淋巴細胞反應，而且VLPs可以直接誘導樹突狀細胞成熟，從而對共刺激分子及細胞因子進行正調控以激活CD8+T淋巴細胞[28－29]。目前，有2種人用VLPs疫苗批準上市，分別是英國葛蘭素史克公司生產的乙型肝炎疫苗和二價人乳頭瘤病毒疫苗以及美國默克公司生產的乙型肝炎疫苗和四價人乳頭瘤病毒疫苗[30]，其他多種病毒VLPs疫苗正在研發或處于臨床試驗階段[31]。由此顯示了VLPs作為疫苗的廣闊應用前景。

RVFV VLPs是一個不被復制的病毒粒子，它由病毒的被膜G1、G2及N蛋白組成，并且吸附到細胞受體上，就像感染了RVFV。在VLPs吸附到細胞受體后，病毒的被膜蛋白在內吞溶酶體內被消化，然后MHC－Ⅱ提呈抗原，這證明VLPs的抗原穩定性和免疫原性超過了可溶性蛋白[32]。N?slund等[33]共表達了 RVFV 的 N、L、G1、G2、78 ku NSm，用 RVFV VLPs免疫老鼠產生的中和抗體滴度是1∶250～1∶1250，被免疫的老鼠在RVFV ZH548病毒株的攻擊中成功獲得保護。實驗表明，基于VLPs的實驗性疫苗（種）在小鼠模型上具有很好的免疫原性，甚至在沒有佐劑存在時也可誘導產生高水平的中和抗體。

4 結 語

總之，每種RVFV疫苗都有自身的優缺點。滅活疫苗雖然安全，但須重復增加劑量；弱毒活疫苗雖然免疫原性較高，但存在毒力回歸的生物安全隱患。近年來，運用反向遺傳技術生產的RVFV疫苗具有高效性和穩定性。基因工程疫苗免疫安全，但由于進行特異性動物模型實驗有限，免疫的途徑、劑量、毒株的篩選、中和抗體的滴度和測定有待確定。VLPs疫苗以其獨特的優勢具有良好的發展前景，但其在規模化生產及如何降低生產成本方面還須進一步改進。

[1] 王華，吳曉東，王志亮，等.裂谷熱的研究新進展［J］.中國動物檢疫，2014，31(3):43-45.

[2]Ikegami T.Molecular biology and genetic diversity of Rift Valley fever virus［J］.Antiviral Res,2012,95(3):293-310.

[3] 文心田，于恩庶，徐建國，等.當代世界人獸共患病［M］.成都：四川科學技術出版社，2011：210-216.

[4]Paweska JT,van Vuren PJ.Rift Valley fever virus:a virus with potential for global emergence［M］//Johnson N.The role of animals in emerging viral diseases.New York:Academic Press,2013:169-200.

[5] 李林，高玉偉，夏咸柱，等.裂谷熱研究進展［J］.動物醫學進展，2011，33(2):96-100.

[6]Keegan K,Collett MS.Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequences of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Valley fever virus［J］.JVirol,1986,58(2):263-270.

[7]Randall R,Gibbs Jr.CJ,Aulisio CG,et al.The development of a formalin-killed Rift Valley fever virus vaccine for use in man［J］.J Immunol,1962,89:660-671.

[8]Rusnak JM,Gibbs P,Boudreau E,etal.Immunogenicity and safety of an inactivated Rift Valley fever vaccine in a 19-year study［J］.Vaccine,2011,29(17):3222-3229.

[9]Kortekaas J.One Health approach to Rift Valley fever vaccine development［J］.Antiviral Res,2014,106:24-32.

[10]Muller R,Saluzzo JF,Lopez N,etal.Characterization of clone 13,a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus,which is altered in the small segment［J］.Am JTrop Med Hyg,1995,53(4):405-411.

[11]Vialat P,Billecocq A,Kohl A,et al.The S segment of Rift Valley fever phlebovirus(Bunyaviridae)carries determinants for attenuation and virulence inmice［J］.JVirol,2000,74(3):1538-1543.

[12]Dungu B,Louw I,Lubisi A,et al.Evaluation of the efficacy and safety of the Rift Valley fever Clone 13 vaccine in sheep［J］.Vaccine,2010,28(29):4581-4587.

[13]von Teichman B,Engelbrecht A,Zulu G,et al.Safety and efficacy of Rift Valley fever Smithburn and Clone 13 vaccines in calves［J］.Vaccine,2011,29(34):5771-5777.

[14]Caplen H,Peters CJ,Bishop DH.Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development［J］.J Gen Virol,1985,66(Pt 10):2271-2277.

[15]Morrill JC,Peters CJ.Pathogenicity and neurovirulence of amutagen-attenuated Rift Valley fever vaccine in rhesus monkeys［J］.Vaccine,21(21-22):2994-3002.

[16]Morrill JC,Peters CJ.Mucosal immunization of rhesus macaques with Rift Valley fever MP-12 vaccine［J］.J Infect Dis,2011,204(4):617-625.

[17]Peters CJ,Pittman PR,Morrill JC,etal.Genetic and clinical evaluation of MP-12:a live attenuated vaccine for Rift Valley fever virus(RVFV)［C/OL］//The eleventh annual conference on vaccine research,Baltimore Marriott Waterfront Hotel,Baltimore,Maryland,May 5-7,2008［2015-01-03］.http://www.nfid.org/professional-education/archives/acvr/acvr08.pdf.

[18]Kortekaas J,Antonis AF,Kant J,etal.Efficacy of three candidate RiftValley fever vaccines in sheep［J］.Vaccine,2012,30(23):3423-3429.

[19]López-Gil E,Lorenzo G,Hevia E,et al.A single immunization with MVA expressing GnGc glycoproteins promotes epitope-specific CD8+-T cell activation and protects immune-competentmice against a lethal RVFV infection［J］.PLoSNegl Trop Dis,2013,7(7):e2309.

[20]Kortekaas J,de Boer SM,Kant J,etal.Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector［J］.Vaccine,2010,28(27):4394-4401.

[21]Crisci E,Bárcena J,Montoya M.Virus-like particles:the new frontier of vaccines for animal viral infections［J］.Vet Immunol Immunopathol,2012,148(3-4):211-225.

[22]Lenz P,Day PM,Pang YY,etal.Papillomavirus-like particles induce acute activation of dendritic cells［J］.J Immunol,2001,166(9):5346-5355.

[23]Storni T,Lechner F,Erdmann I,etal.Critical role for activation of antigen-presenting cells in priming of cytotoxic T cell responses after vaccination with virus-like particles1［J］.J Immunol,2002,168(6):2880-2886.

[24]Liu F,Wu X,Li L,etal.Virus-like particles:promising platforms with characteristics of DIVA for veterinary vaccine design［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2013,36(4):343-352.

[25]Bachmann MF,Lutz MB,Layton GT,etal.Dendritic cells process exogenous viral proteins and virus-like particles for class Ipresentation to CD8+cytotoxic T lymphocytes［J］.Eur JImmunol,1996,26(11):2595-2600.

[26]Win SJ,Ward VK,Dunbar PR,et al.Cross-presentation of epitopes on virus-like particles via the MHC I receptor recycling pathway［J］.Immunol Cell Biol,2011,89(6):681-688.

[27]Pejawar-Gaddy S,Rajawat Y,Hilioti Z，etal.Generation of a tumor vaccine candidate based on conjugation of a MUC1 peptide to polyionic papillomavirus virus-like particles［J］.Cancer Immunol Immunother,2010,59(11):1685-1696.

[28]Bosio CM,Moore BD,Warfield KL,et al.Ebola and Marburg virus-like particles activate humanmyeloid dendritic cells［J］.Virology,2004,326(2):280-287.

[29]Yang R,Murillo FM,Cui H,et al.Papillomavirus-like particles stimulate murine bone marrow-derived dendritic cells to produce alpha interferon and Th1 immune responses via MyD88［J］.JVirol,2004,78(20):11152-11160.

[30]Kushnir N,Streatfield SJ,Yusibov V.Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform:diversity of targets and production systems and advances in clinical development［J］.Vaccine,2012,31(1):58-83.

[31]Chackerian B.Virus-like particles:flexible platforms for vaccine development［J］.Expert Rev Vaccines,2007,6(3):381-390.

[32]Ludwig C,Wagner R.Virus-like particles-universal molecular toolboxes［J］.Curr Opin Biotechnol,2007,18(6):537-545.

[33]N?slund J,Lagerqvist N,Habjan M,etal.Vaccination with viruslike particles protects mice from lethal infection of Rift Valley fever virus［J］.Virology,2009,385(2):409-415.