α-enolase蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

朱禮昆，楊蔚琪，楊 云

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 整形外科，云南 昆明 650032）

α-enolase（ENO1） 是烯醇化酶家族中3種同功酶之一，是一種多功能的蛋白，作為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，α-enolase廣泛分布在原核和真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其基因表達(dá)隨細(xì)胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變[1]。Jiang等[2]通過構(gòu)建結(jié)腸癌相關(guān)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)：α-enolase與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)過程相關(guān)聯(lián)，并且是結(jié)腸癌相關(guān)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的中心基因之一，這提示α-enolase可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于口腔頜面部腫瘤的首位，并且近年來仍有上升趨勢(shì)。本研究通過測(cè)定α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，探討其與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，這對(duì)揭示口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的精確分子機(jī)制，設(shè)計(jì)合理的治療藥物及判斷預(yù)后，進(jìn)一步提高我國口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療水平具有重要意義。

材料和方法

一、一般資料 收集2010年1月-2012年10月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院整形外科術(shù)前未經(jīng)任何治療的口腔鱗狀細(xì)胞癌蠟塊40例，其中男性24例，女性16例，平均年齡58.5歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，根據(jù)腫瘤分化程度分為低分化、中分化和高分化鱗癌，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC） 2002年口腔癌分期標(biāo)準(zhǔn)，包括I+II期25例，III+IV期15例。對(duì)照組10例，均為正常口腔黏膜組織。

二、主要實(shí)劑及儀器 ELISA試劑盒：北京鑫方程生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)FU-E10980。PCR儀：ABI儀器型號(hào)9700。基因組提取試劑盒：莊盟生物，產(chǎn)品編號(hào)ZP311 2X。SYBR MIX：莊盟生物，產(chǎn)品編號(hào)ZF101。

三、方法 1．ELISA定量測(cè)定α-enolase濃度：操作步驟參照文獻(xiàn)[3]。

2．利用real-time PCR測(cè)定α-enolase mRNA表達(dá)：用TRIzol法抽提總mRNA，測(cè)定其濃度和純度，用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。α-enolase上游引物：5'-ATTGAGCTAGATGGGACCGAGAAT-3'，下游引物：5'-CACTGGGAGTATGAGGTCAGGGTT-3'，PCR產(chǎn) 物159bp；β-actin上游引物：5'-TCATGAAGTGTGACGTGGACA-3'，下 游 引 物： 5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3'，PCR 產(chǎn) 物158bp。PCR條 件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性2s，59℃退火延伸30s，50個(gè)循環(huán)；72℃終延伸12s。

結(jié) 果

一、口腔鱗狀細(xì)胞癌中α-enolase蛋白的表達(dá)由附圖可見，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中α-enolase蛋白表達(dá)明顯高于正常粘膜組織（P＜0.05）；由表1可見：α-enolase蛋白在低、中、高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)均有差異（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高分化鱗癌的α-enolase濃度＞中分化鱗癌＞低分化鱗癌；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為III+IV期者α-enolase的表達(dá)分別明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為I+II期者（P＜0.05）。

二、口腔鱗狀細(xì)胞癌中α-enolase蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 由表2可見，α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）。

附圖 口腔鱗狀細(xì)胞癌、正常粘膜組織中α-enolase蛋白結(jié)果比較

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌α-enolase濃度（±s,ng/ml）

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌α-enolase濃度（±s,ng/ml）

注：低分化鱗癌與中分化鱗癌比較▲P＜0.05；中分化鱗癌與高分化鱗癌比較△P＜0.05；低分化鱗癌與高分化鱗癌比較◇P＜0.05；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較●P＜0.05；III+IV期患者與I+II期比較☆P＜0.05。

組分 n淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 12無轉(zhuǎn)移 28 α-enolase濃度960.6±15.40 857.86±30.45●P 0.036低分化 16 839.28±17.49 0.029中分化 12 906.00±11.92▲ 0.032高分化 12 987.06±16.79△◇ 0.048 III+IV期 15 998.86±30.45☆ 0.021 I+II期 25 852.87±14.24

表2 口腔鱗狀細(xì)胞癌中α-enolase蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

討 論

烯醇化酶（enloase，ENO） 是糖酵解途徑中催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岽际奖岬拿福┐蓟讣易灏é?enolase（ENO1）、β-enolase和γ-enolase。α-enolase作為一種糖酵解酶，廣泛分布在原核和真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是一個(gè)高度保守的胞漿酶類，由兩個(gè)含有433個(gè)氨基酸，分子量約47kDa的亞單位反向平行結(jié)合構(gòu)成的二聚體，在細(xì)胞質(zhì)中起催化作用，形成磷酸烯醇式丙酮酸[4]。在臨床上，γ-enolase已作為一種常用于指導(dǎo)小細(xì)胞肺癌患者的療效監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估的血清腫瘤標(biāo)志物。

以往認(rèn)為糖酵解代謝酶的生物學(xué)活性只是催化能量代謝，然而Kim等[5]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解酶都是具有多功能的蛋白，其所涉及的其他生物學(xué)功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)；最近研究發(fā)現(xiàn)，烯醇化酶是一種多功能蛋白，其多樣性主要體現(xiàn)在細(xì)胞定位和功能上[6]。位于細(xì)胞膜的α-enolase能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，α-enolase蛋白的C端具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（包含16個(gè)氨基酸），以此錨定于細(xì)胞膜[7]。Jiang及同事[2]通過構(gòu)建結(jié)腸癌相關(guān)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)：α-enolase與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)過程相關(guān)聯(lián)，并且是結(jié)腸癌相關(guān)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的中心基因之一，這提示α-enolase可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

在臨床上，γ-enolase已作為一種用于指導(dǎo)小細(xì)胞肺癌患者的療效監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估的血清腫瘤標(biāo)志物。鑒于α-enolase與γ-enolase是同一家族，近年來越來越多的研究者開始關(guān)注α-enolase作為腫瘤標(biāo)志物的潛能。目前在腫瘤組織中α-enolase的表達(dá)水平及其與患者臨床相關(guān)性尚無明確定論，有研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性肺癌的肺泡Ⅱ型肺泡、小細(xì)胞肺癌、頭頸癌患者腫瘤組織中，α-enolase表達(dá)水平是上調(diào)[8-10]。2003年Chang及其同事研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中，α-enolase表達(dá)水平顯著下調(diào)，α-enolase表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)量越低，患者預(yù)后越差[11]，這提示α-enolase可能抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。然而更多研究表明，α-enolase與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在正相關(guān)。α-enolase作為肺癌相關(guān)抗原，在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差[12]；頭頸癌患者腫瘤組織中α-enolase顯著高于正常對(duì)照組，其表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差[13]；乳腺癌患者腫瘤組織中α-enolase的mRNA水平顯著高于配對(duì)正常組織，并且這種改變?cè)诖萍に厥荏w陽性（ER+） 的乳腺癌亞型中尤明顯，α-enolase表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差[14]。

口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于口腔頜面部腫瘤的首位，并且近年來仍有上升趨勢(shì)。本研究通過ELISA法測(cè)定α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中α-enolase蛋白表達(dá)明顯高于正常粘膜組織，α-enolase的高表達(dá)量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度、TNM分期的增加，α-enolase的表達(dá)會(huì)增加，提示在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中α-enolase蛋白表達(dá)上調(diào)，α-enolase可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用，這與在其他腫瘤中的研究結(jié)論基本相-致[8-10]，但這些研究多以腫瘤組織與癌旁組織為標(biāo)本，多應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行研究的，而我們的實(shí)驗(yàn)是以腫瘤組織與正常人黏膜組織為標(biāo)本，應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行研究。總之，本研究雖然通過測(cè)定α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，探討其與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展過種中起著重要作用，但只是停留在分子表淺層面，對(duì)臨床診斷和治療能提供些參考和建議，究其根源需要在基因水平上明確α-enolase在肺腺癌組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確α-enolase在口腔鱗狀細(xì)胞癌中所占居的重要地位，進(jìn)而盡早明確是否可以應(yīng)用于臨床診斷和治療。

［1］TERRIER B,DEGANDN,GUILPAINP,et al.Alpha-enolase:a target of antibodies in infectious and autoimmune diseases[J]．Autoimmun Rev,2007,6(3):176-182.

［2］JIANGW,LIX,RAOS,et al.Constructing disease-specific gene networks using pair-wise relevance metric:application to colon cancer identifies interleukin 8,desmin and enolase 1 asthecentral elements[J]．BMCSyst Biol,2008,2:72.

［3］KANEKON,GOTOH A,OKAMURA N,et al.Potential tumor markers of renal cell carcinoma:alpha-Enolase for postoperative follow up,and galectin-1 and galectin-3 for primary detection[J]．Int JUrol,2013,20(5):530-535.

［4］BAYSAL BE,FERRELL RE,WILLETT-BROZICK JE,et al.Mutations in SDHD,a mitochondrial complex II gene,in hereditary paraganglioma[J]．Science(80-),2000,287(5454):848-851.

［5］KIMJW,DANGCV.Multifaceted roles of glycolytic enzymes[J]．Trends Biochem Sci,2005,30(3):142-150.

［6］PANCHOLI V.Multifunctional alpha-enolase:its role in diseases[J]．Cell Mol Life Sci,2001,58(7):902-920.

［7］ARZA B,FELEZJ,LOPEZ-ALEMANY R,et al.Identification of an epitope of alpha-enolase(a candidate plasminogen receptor)by phage display[J]．Thromb Haemost,1997,78(3):1097.

［8］PEEBLESKA,DUNCAN MW,RUCH RJ,et al.Proteomic analysis of a neoplastic mouse lung epithelial cell line whose tumorigenicity has been abrogated by transfection with the gap junction structural gene for connexin 43,Gja1[J]．Carcinogenesis,2003,24(4):651-657.

［9］ZHANG L,CILLEY RE,CHINOY MR.Suppression subtractive hybridization to identify gene expressions in variant and classic small cell lung cancer cell lines[J]．JSurg Res,2000,93(1):108-119.

［10］WUW,TANGX,HUW,et al.Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J]．Clin Exp Metastasis,2002,19(4):319-326.

［11］CHANGYS,WUW,WALSH G,et al.Enolase-alphais frequently down-regulated in non-small cell lung cancer and predicts aggressive biological behavior[J]．Clin Cancer Res,2003,9(10 Pt 1):3641-3644.

［12］CHANGGC,LIUKJ,HSIEH CL,et al.Identification of alpha-enolase as an autoantigen in lung cancer:its overexpression is associated with clinical outcomes[J]．Clin Cancer Res,2006,12(19):5746-5754.

［13］TSAIST,CHIEN IH,SHENWH,et al.ENO1,a potential prognostic head and neck cancer marker,promotes transformation partly via chemokine CCL20 induction[J]．Eur JCancer,2010,46(9):1712-1723.

［14］TUSH,CHANGCC,CHENCS,et al.Increased expression of enolase alpha in human breast cancer confers tamoxifen resistance in human breast cancer cells[J]．Breast Cancer Res Treat,2010,121(3):539-553.