人轉鐵蛋白含量同位素稀釋質譜測定方法研究

李佳樂，武利慶，劉文麗，金有訓，陳鴻飛，楊 彬，楊 屹

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013；3.南京市計量監督檢測院，江蘇 南京 210037）

人轉鐵蛋白含量同位素稀釋質譜測定方法研究

李佳樂1，武利慶2，劉文麗2，金有訓2，陳鴻飛3，楊 彬2，楊 屹1

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013；3.南京市計量監督檢測院，江蘇 南京 210037）

建立一種人轉鐵蛋白（hTRF）純品含量同位素稀釋質譜測定方法。人轉鐵蛋白經酸水解后，以水（含0.8mmol/L全氟庚酸和0.1%三氟乙酸）和乙腈為流動相，以氨基酸國家標準物質為標準，同位素標記氨基酸為內標，采用高效液相色譜-同位素稀釋聯用法對水解液中的脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸進行測定，并進一步計算得出蛋白純品的含量。同時采用質量平衡法測定人轉鐵蛋白的含量，驗證所建方法的可行性。在優化的條件下，人轉鐵蛋白含量測定結果為0.830 g/g，相對標準偏差為0.6%，擴展不確定度為0.014 g/g（k=2），檢出限和定量限分別為3.78×10-5g/g和1.26×10-4g/g。所建方法準確度高、溯源清晰，可作為人轉鐵蛋白純品標準物質的定值方法，對于建立我國人轉鐵蛋白測定結果的量值溯源傳遞體系具有積極的意義。

人轉鐵蛋白；定量；同位素稀釋質譜法；質量平衡法

0 引 言

人轉鐵蛋白（human transferrin，hTRF）是由肝臟合成的一種與三價鐵結合的糖蛋白，不僅在人體中輸運鐵，還是一種重要的疾病診斷標志物。

血清中hTRF的檢測通常采用免疫法、液相色譜法、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）法。Johnson和趙光斌等[1-2]均采用放射免疫法檢測并定量了hTRF。Srikrishnan等[3]將親硫相互作用色譜法運用于血清中hTRF的測定。Wang等[4]采用18O標記和液質聯用技術定量了人血清中的hTRF。根據ISO 17511——2003《體外診斷醫療器械-生物樣品中量的測量-校準品和控制物質賦值的計算學溯源性》[5]，需要研制可溯源到SI單位、含量準確的高純蛋白作為標準，以保證不同時間、不同地域實驗室檢測結果的準確可比；因此，必須建立高準確度的hTRF純品含量測定方法。

對于蛋白純品的定量，目前主要有氨基酸分析、質量平衡、定量核磁和同位素稀釋質譜（IDMS）技術。氨基酸分析是將蛋白質水解成氨基酸后，在氨基酸分析儀上通過紫外或熒光檢測分析蛋白質含量[6]。戴新華等[7]采用質量平衡法測定了L-纈氨酸的純度，證實該方法是一種準確度較高的方法。黃挺等[8]對定量核磁共振法做了深入研究，證實該方法可用于化合物的純度定值和含量測定，具有較好的精密度和重復性。Mu?oz等[9]采用基于4種氨基酸的IDMS技術準確測定了多種蛋白和多肽，并對比定量結果與氨基酸分析結果，表明該方法操作簡單，準確度和精密度較高。因此，本文主要建立了hTRF的同位素稀釋質譜方法，并用純度扣除法進行驗證。

1 儀器及試劑

三重四極桿液質聯用（TSQ Vantage LC-MS MS）：美國Thermo公司；高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國安捷倫公司；垂直電泳槽：美國伯樂公司；MALDI-TOF-MS：美國Bruker公司；天平：ME235S型，感量0.01 mg，德國Satorius公司；離心干燥機：RC10-22T型，美國Thermo公司；烘箱：UFE500，德國Memmert公司；移液器（10，20，100，200，1000μL）：法國Gilson公司；超純水系統：Milli-Q型，美國MILLIPORE公司；卡爾費休水分測定儀：DL39型，德國Mettler Toledo公司；馬弗爐：FP31型，日本Yamato公司。

標記氨基酸（13C5-脯氨酸，13C9-苯丙氨酸，13C5-纈氨酸）：美國劍橋同位素實驗室；脯氨酸（GBW（E）100084，Pro）、苯丙氨酸（GBW（E）100061，Phe）、纈氨酸（GBW（E）100055，Val）國家標準物質：中國計量科學研究院；芥子酸（SA）：美國Bruker公司；α-氰基-4-羥基苯丙烯酸（HCCA）：美國Bruker公司；hTRF：北京安必奇生物科技有限公司：全氟庚酸（PHFA）：美國Sigma-Aldirich公司；三氟乙酸（TFA）：中國DikmaPure公司；乙腈（MeCN）：美國J.T Baker公司；蛋白質預制膠：7 cm×8 cm，膠厚1.0 mm，美國伯樂公司；10×SDS緩沖溶液：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；彩虹預染寬分子量蛋白Marker（10～260kD），中國中科瑞泰公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）：北京國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶：美國Promega公司；二硫蘇糖醇（DTT）：美國Sigma-Aldirich公司；碘乙酰胺（IAA）：美國Sigma-Aldirich公司；Rapigest變性劑：美國Waters公司；胰蛋白酶（Trypsin）：美國Promega公司；碳酸氫銨：廣東西隴化工股份有限公司；Milli-Q超純水；其余試劑均為分析純。

2 hTRF基本性質表征

2.1 SDS-PAGE純度測定

將蛋白質預制膠放入垂直電泳槽內，倒入電泳緩沖液（1×），充分浸泡預制膠。將1 mg/mL的hTRF水溶液和上樣緩沖液以50：20（ν：ν）的比例加入1.5mL離心管中，在100℃水浴鍋中煮沸10min，取出靜置。將彩虹預染寬分子量蛋白Marker從-20℃取出，放至室溫，離心待用。在蛋白預制膠的每個孔中上樣10μL后開始電泳分析。結束后用考馬斯亮藍染色1h，加脫色液（水、甲醇和冰醋酸以5：4：1（ν：ν：ν）的比例配制）過夜脫色。電泳條件：電壓100V，電泳時間90min。

2.2 MALDI-TOF分子量測定

將1mg/mL的hTRF水溶液用0.1%甲酸水稀釋10倍后，取5μL與SA基質1：1混勻，然后再取1μL點板，干燥后推入質譜中進行分子量和蛋白質鑒定，平行測定6次。

2.3 蛋白質鑒定

稱取hTRF 0.4mg，加入100μL含0.1%Rapigest的50mmol/L的碳酸氫銨溶液，渦旋混勻，然后加入35μL 0.1mol/L的DTT，渦旋混勻，60℃水浴15min；冷卻到室溫后，加入35 μL IAA，暗反應40 min，然后再加入105 μL 0.1 mol/L的DTT以除去過剩的IAA，最后加入5μL胰蛋白酶，37℃孵育過夜，反應結束后，加200μL 0.1mol/L HCl終止反應，用0.22μm的濾膜過濾后取2μL與基質HCCA同比例混勻點靶板，用MALDI-TOF測定后搜索Swissprot數據庫進行蛋白質鑒定。參數設置如表1所示。

表1 蛋白質鑒定參數設置

3 質量平衡法測定hTRF蛋白質含量

3.1 水分測定

每次準確稱量大約5 mg hTRF樣品用卡爾費休水分測定儀進行測定，平行測定3次。

3.2 灰分測定

采用灼燒殘渣法測定hTRF灰分。先將潔凈的坩堝在馬弗爐里灼燒至恒重，加入準確稱量的約20 mg hTRF樣品，再次灼燒至恒重，根據灼燒后殘留質量計算灰分含量。

3.3 反相高效液相色譜測定hTRF純度

將hTRF用純水配成1mg/mL的溶液，同比例加入已配好的1.5mg/mL的EDTA二鈉鹽溶液，進行高效液相色譜分析。色譜柱為Agilent 300SB-C18（2.1mm×75mm×5μm，USA）；柱溫40℃；流量1mL/min；UV檢測波長215nm；進樣量20μL。流動相及梯度如表2所示。

表2 hTRF反相高效液相色譜純度測定流動相及梯度 %

4 HPLC-IDMS法測定hTRF蛋白質含量

4.1 hTRF樣品的水解

采用最小分度為0.01 mg的天平稱取約10 mg hTRF樣品，溶于10 mL純水中，配成1 mg/mL的蛋白溶液。取100μL母液，加到2mL安瓿瓶中，再加入100μL標記氨基酸混標溶液。置于真空離心干燥儀中離心干燥70min，待樣品中水分全部除去后取出，加入500μL 6 mol/L鹽酸，通氮2min除氧后密封，在（110.0±0.5）°C的烘箱中進行水解。水解后氮氣吹干，用500μL水（含0.1%甲酸）復溶，經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

4.2 HPLC-IDMS分析

色譜條件：色譜柱為Agilent SB-Aq（2.1mm×150mm）；流量為0.2mL/min。流動相及梯度如表3所示。

表3 hTRF HPLC-IDMS純度測定流動相及梯度 %

質譜條件：離子對質荷比：脯氨酸：116-＞70（Pro）和121-＞74（標記Pro）；纈氨酸：118-＞72（Val）和123-＞76（標記Val）；苯丙氨酸：166-＞120（Phe）和174-＞128（標記Phe）。

5 結果與討論

5.1 hTRF基本性質的表征

5.1.1 SDS-PAGE純度測定結果

hTRF SDS-PAGE電泳純度測定結果如圖1所示，hTRF條帶位于66.2～94.0kDa之間，與文獻報道一致。hTRF濃度較高時，在45.0～66.2 kDa之間可見一條雜蛋白的條帶。

圖1 hTRF SDS-PAGE電泳純度測定結果（單位：kDa）

5.1.2 MALDI-TOF分子量測定結果

進行6次重復測定hTRF MALDI-TOF，其平均值為78.17 kDa，RSD為0.02%，分子量測定結果與SDS-PAGE測定結果和文獻報道均一致。在52.25kDa分子量處可見一雜蛋白的峰，與SDS-PAGE測定結果一致。

5.1.3 蛋白質鑒定結果

hTRF酶切后的質譜圖如圖2所示，從圖中可見酶切出的肽段，使用肽質量指紋譜（PMF）數據經Mascot軟件在Swissprot數據庫中進行蛋白質鑒定，結果顯示，所鑒定肽段來自于TRFE_HUMAN，Score為80。

5.2 質量平衡法測定hTRF含量

圖2 hTRF酶切后的質譜圖

采用卡爾費休水分測定儀對hTRF樣品進行3次重復測定，結果平均值為11.24%，RSD為1.0%。經灼燒殘渣法測定的hTRF灰分含量為3.08%。反相高效液相色譜純度測定結果如圖3所示，當直接采用HPLC對hTRF純度進行測定時，在主峰的位置上存在一個肩峰（如圖3（a）中A線所示），該峰是由于hTRF處于鐵螯合狀態和非螯合狀態導致的。為消除螯合狀態對蛋白質純度測定的影響，采用EDTA螯合除去鐵后再進行分析，可得到光滑的色譜峰（如圖3（a）中B線所示）。先后優化了EDTA與蛋白的比例對純度測定的影響，固定hTRF質量濃度為1mg/mL，考察了EDTA質量濃度分別為0.5～10 mg/mL時的測定結果，當EDTA質量濃度為1.5mg/mL時，可得到理想的分離分析結果。重復分析5次，純度測定結果為96.28%，相對標準偏差為0.3%。根據式（1）采用質量平衡法計算hTRF的含量。

式中：w——蛋白純度；

P——反相HPLC法測定的蛋白純度；A——水分含量；B——灰分含量。

經計算，質量平衡法測定的hTRF質量分數為82.49%。

5.3 HPLC-IDMS測定hTRF含量

5.3.1 水解時間的優化

為了確保蛋白質能夠定量水解成氨基酸，需要對水解時間進行優化，選取水解時間曲線的最高點或平臺期作為最佳的水解時間。分別考察了水解時間為16～96 h時水解液中Pro、Val和Phe的相對比例，結果如圖4所示。從圖中可以看出，當水解時間達到40h時，3種氨基酸的相對比例都達到了峰值，因此選定40h為hTRF的最佳水解時間。

5.3.2 方法準確性、重復性和再現性評價

圖3 反相高效液相色譜純度測試結果

圖4 hTRF水解時間優化結果

首先，對HPLC-IDMS法測定hTRF樣品結果的不確定度進行評定。實驗時，采用了Pro、Val和Phe分別對蛋白質含量進行測定，并取其平均值。分別計算各個氨基酸對蛋白質定量結果的不確定度，以Phe為例，測量不確定度主要來源于稱量、水解效率、方法重復性和氨基酸標準物質。稱量的不確定度依據JJG 1036——2008《電子天平》[10]確定稱量Phe及溶液時的最大允許誤差分別為0.015 mg和按照均勻分布，計算由稱量引入的不確定度分量分別為

方法重復性引入的不確定度分量按照不確定度的A類評定方法評價，一共對樣品進行了5次重復測定，結果的相對標準偏差為0.77%，因此，測定結果平均值的重復性相對不確定度為

根據Phe國家標準物質證書，Phe的定值結果為（99.9±1.5）%，其包含因子k=2，所以由Phe標準物質引入的不確定度分量為

相對不確定度為

類似的，經計算采用Pro和Val測定蛋白質含量結果的合成不確定度分別為

最后結果的不確定度為

方法的擴展不確定度為

比較了hTRF樣品的HPLC-IDMS測定結果與質量平衡法測定結果，兩者的相對偏差僅為0.6%，并且質量平衡法的測定結果在HPLC-IDMS法測定結果的不確定度范圍內，說明HPLC-IDMS法對hTRF樣品的測定結果準確可靠。

采用優化建立的HPLC-IDMS方法對同一hTRF樣品進行5次重復測定，所得結果平均值為0.834g/g，RSD為0.3%，可見所建方法重復性良好。

采用優化建立的HPLC-IDMS方法對11個hTRF樣品、每個樣品重復測定3次，所得結果平均值為0.830g/g，RSD為0.6%，可見所建方法再現性良好。

5.3.3 檢出限與定量限評價

根據下式計算HPLC-IDMS方法的檢出限和定量限：

式中：Rm-STD——標準溶液中氨基酸與同位素標記氨基酸的質量比；

Rh-STD——標準溶液中氨基酸與同位素標記氨基酸的峰高比；

Msample——樣品溶液中同位素標記氨基酸的質量，g；

msample——樣品溶液中氨基酸的質量，g；

Rh-sample——非標記氨基酸通道中3倍或10倍噪音信號強度與相應的標記氨基酸信號強度之比。

經計算，hTRF的檢出限與定量限分別為3.78×10-5g/g和1.26×10-4g/g。

6 結束語

本文建立了人轉鐵蛋白純品含量HPLC-IDMS測定方法，經方法學參數考察和與質量平衡法測定結果的比較，所建方法具有溯源清晰、準確度高的特點，可作為人轉鐵蛋白純品標準物質的定值方法，對于建立我國人轉鐵蛋白測定結果的量值溯源傳遞體系、保證臨床檢驗中人轉鐵蛋白測定結果的準確、可比具有積極的意義。

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[10]JJG 1036—2008電子天平[S].北京：中國計量出版社，2008.

Determination on mass fraction of pure human transferrin through high performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry

LI Jiale1，WU Liqing2，LIU Wenli2，JIN Youxun2，CHEN Hongfei3，YANG Bin2，YANG Yi1

（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China；3.Nanjing Institute of Measurement and Testing Technology，Nanjing 210037，China）

This paper discusses a high performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry（HPLC-IDMS）method established to determine the mass fraction of pure human transferrin（hTRF）.It comprises the following steps:first，hydrolyze the pure hTRF with acid and use water（containing 0.8mmol/L of perfluoroheptanoic acid and 0.1%of trifluoroacetic acid）and acetonitrile as mobile phases;second，quantify the proline，valine and phenylalanine in the hydrolysate with the HPLC-IDMS method based on amino acids-national reference materials and isotope-labeled amino acids-internal standards;and third，calculate the mass fraction of pure hTRF according to the results of the above steps.In addition，the hTRF was also quantified by the mass balance method to verify the feasibility of the established method.Under optimized conditions，the hTRF had a mass fraction of 0.830g/g，with a relative standard deviation（RSD）of 0.6%and an expanded uncertainty of 0.014g/g（k=2）.The detection and quantitation limits were 3.78×10-5g/g and 1.26×10-4g/g，respectively.Characterized by high accuracy and clear traceability，this method can be applied to determine the reference material amounts in pure hTRFs，playing a significant role in the establishment of valuation transfer and traceability systems for hTRF detection in China.

human transferrin；mass fraction；isotope dilution mass spectrometry；mass balance method

A

：1674-5124（2015）05-0058-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.05.015

2014-10-17；

：2014-12-05

質檢總局公益行業專項項目（201310008）

李佳樂（1990-），女，內蒙古呼和浩特市人，碩士研究生，專業方向為分析化學。