茶樹根抗痛風活性部位的篩選研究*

*基金項目：江西省衛生計生委中醫藥科研計劃項目(2015B017)；江西中醫藥大學重點學科教師培養計劃資助項目(2012jzzdxk018)。

茶樹根抗痛風活性部位的篩選研究*

*基金項目：江西省衛生計生委中醫藥科研計劃項目(2015B017)；江西中醫藥大學重點學科教師培養計劃資助項目(2012jzzdxk018)。

★余雄英1周軍1**曹樹穩2左愛仁1(1. 江西中醫藥大學南昌 330004 ； 2，南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室南昌 330047)

摘要：目的：比較茶樹根總黃酮和總皂苷對高尿酸血癥小鼠尿尿酸、血尿酸、血黃嘌呤氧化酶活性的影響和對抗急性痛風性關節炎作用以及體外對黃嘌呤氧化酶活性抑制作用，探討茶樹根防治痛風的活性部位。方法：用尿酸和氧嗪酸鉀ip小鼠造成小鼠高尿酸血癥模型，分光光度法檢測尿酸水平和黃嘌呤氧化酶活力；以尿酸鈉結晶植入法觀察茶樹根總黃酮和總皂苷抗急性痛風性關節作用;以含酶動力學分析軟件的分光光度計在波長290nm處測定茶樹根總黃酮和總皂苷對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用。結果：茶樹根總黃酮在降血尿酸和促尿酸排泄以及抑制黃嘌呤氧化酶活性上起主要作用，茶樹根總皂苷則對急性痛風性關節炎起主要抑制作用。結論：茶樹根總黃酮和總皂苷均為茶樹根抗痛風的藥效部位。

關鍵詞：茶樹根；總黃酮； 總皂苷；抗痛風；活性部位

痛風是一種慢性代謝紊亂性疾病，它的主要特點是高尿酸血癥[1]。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，全球痛風發病率與日俱增，并呈年輕化趨勢，成為第二大威脅人類生命和健康的代謝性疾病,因此研發防治痛風、高尿酸血癥的藥物成為目前醫藥界研究的一個熱點。現代醫學理論證實痛風病的致病因素之一是黃嘌呤氧化酶，黃嘌呤氧化酶簡稱XOD。XOD是體內尿酸生成的關鍵酶，它能催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉化為尿酸?？芍猉OD抑制劑可減少體內尿酸生成，防治痛風發生。此外，促進尿酸排泄也可治療痛風，另外，抗炎鎮痛藥物可減輕痛風癥狀，減少病人痛苦。因此尋求安全有效，具有綜合防治痛風作用的藥物對高尿酸血癥、痛風患者來說是一種福音。

茶樹根是山茶科山茶屬植物茶的根，味苦，性平，具有強心利尿、抗菌消炎等功效[2]。在江西民間茶樹根還常被用來治療痛風。在我們的前期實驗中發現茶樹根水煎劑抗痛風作用是較全面的。但茶樹根抗痛風作用的物質基礎和作用機制尚不明確，因此本實驗通過觀察茶樹根各藥效部位對高尿酸血癥模型小鼠的尿酸、XOD水平的影響，對急性痛風性關節炎模型小鼠的作用，以及它們體外對XOD活性的抑制作用，探討茶樹根抗痛風的藥效物質和作用機制。

1材料

1.1實驗藥材藥材茶樹根采挖于江西井岡山，經鑒定為山茶科山茶屬植物茶(原變種)Camelliasinensis(L.) O.Ktze. var. sinensis 的根。

1.2試劑AB-8型大孔樹脂(南開大學化工廠);蘆丁(中國藥品生物制品檢定所,批號100080-200707)；熊果酸(中國藥品生物制品檢定所,批號100080-2010 07)；氧嗪酸鉀鹽，尿酸，黃嘌呤氧化酶，黃嘌呤，別嘌呤醇均購自美國Sigma 公司;吲哚美辛片(江蘇亞邦藥業集團股份有限公司制造分公司);尿酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110527);XOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110628)；其余試劑為分析純。

1.3儀器藥物粉碎機、恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市順華儀器有限公司)；藥物天平(上海醫用激光儀器廠)；電子天平( 江蘇常熟長青儀器儀表廠)；游標卡尺(東莞宇誠精密儀器有限公司)；紫外分光光度計(日本島津) 。

1.4動物雄性昆明種小鼠，體重(22±2)g，由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供，使用許可證號：SCXK(贛)2011-0001。實驗小鼠于實驗前在實驗室喂養1周。

2方法

2.1茶樹根總黃酮和總皂苷的提取與含量測定茶樹根粗粉用10倍量70%乙醇回流2次(1.5h，1h)，減壓回收乙醇至無醇味，得茶樹根濃縮液。茶樹根濃縮液進行AB-8大孔吸附樹脂柱層析，依次用水，30%乙醇，70%乙醇，95%乙醇洗脫，去除水洗脫部分和95%乙醇洗脫部分， 將30%乙醇洗脫部分和70%乙醇洗脫部分分別濃縮至無醇味，凍干分別作為茶樹根總黃酮和總皂苷樣品。參照文獻[3]，以熊果酸為標樣,采用香草醛-冰醋酸顯色法測定茶樹根30%乙醇洗脫部分與70%乙醇洗脫部分的總皂苷含量，以蘆丁為標樣,采用亞硝酸鈉，硝酸鋁顯色法測定茶樹根30%乙醇洗脫部分與70%乙醇洗脫部分的總黃酮含量。

2.2高尿酸模型小鼠體內抗痛風藥效實驗進行藥效部位群的篩選

2.2.1動物造模參照文獻方法[4-6]用氧嗪酸鉀和尿酸ip小鼠，增加血清尿酸水平，造成小鼠高尿酸血癥模型。雄性昆明種小鼠適應性飼養一周后隨機分成生理鹽水組、高尿酸模型組、茶樹根總黃酮組、茶樹根總皂苷組、別嘌呤醇組共5組，每組10只。除生理鹽水組外，其他各組均以氧嗪酸鉀和尿酸ip小鼠，連續2 d進行造模以增加血清尿酸水平，造成小鼠高尿酸血癥模型。

2.2.2實驗操作生理鹽水組和高尿酸模型組每天均按20 mL/kg劑量ig生理鹽水,連續6d,別嘌呤醇組(10 mg/kg)每天ig給藥1次，持續6 d，茶樹根總黃酮組、茶樹根總皂苷組小鼠以0.548g/kg劑量灌喂6d,從給藥第5天開始，除生理鹽水組外，其他各組每天ig給藥前1h 均要ip氧嗪酸鉀和尿酸，氧嗪酸鉀和尿酸的劑量分別為0.3g/kg和0.25g/kg，每天1次，連續2 d進行造模。在第5天ig給藥后將小鼠放置代謝籠內，每5只一籠，只給自由飲水，不給飼料，收集尿液5h, 新鮮尿樣以3000r/min離心15min，取上清液進行尿液尿酸測定。收集尿液后小鼠繼續喂養，在第6天ig給藥1h后從小鼠股動脈進行采血，血樣分別置于1.5mL 離心管中，在4℃冰箱中凝固2h,在3000r/min低溫離心5min。每份血樣血清進行血清尿酸水平和血清XOD活力測定。

2.2.3生化指標檢測分別測定小鼠尿尿酸、血尿酸水平和血XOD活性。采用磷鎢酸法檢測各組小鼠尿尿酸和血尿酸，酶比色法檢測XOD活性。具體操作按試劑盒說明書進行。

2.3茶樹根藥效部位對急性痛風性關節炎模型小鼠的影響

2.3.1尿酸鈉溶液的制備參照文獻[7]略作改進，取l g尿酸加氫氧化鈉(1mM)200mL，煮沸，用1N鹽酸調pH至7.2 ，攪拌冷卻后于4℃冰箱中過夜析晶，抽濾干燥得尿酸鈉結晶。 取尿酸鈉結晶，以生理鹽水作溶劑， 以總體積的10%的量加入吐溫80，調配成25mg/mL尿酸鈉混懸液備用。

2.3.2急性痛風性關節炎小鼠模型建立在文獻[8]方法上略改進，用6號注射針在實驗小鼠右足墊部注射尿酸鈉混懸液0.05mL，建立小鼠急性痛風性關節炎模型。

2.3.3實驗操作50只雄性小鼠隨機分為5組，每組10只。造模前6天開始灌胃給藥(茶樹根總黃酮組、茶樹根總皂苷組小鼠以0.548 g/kg劑量，吲哚美辛組以0.05mg/kg劑量)，每日1次 。生理鹽水組以同體積生理鹽水灌胃。于末次給藥30min后,除生理鹽水組小鼠在右足墊部注射生理鹽水0.05mL外，其余各組在小鼠右足墊部注射尿酸鈉混懸液0.05mL，誘導急性痛風性關節炎發生。分別用游標卡尺測量各組小鼠在致炎前后1,3,5h后測定小鼠右足墊部的厚度，以致炎前后的差值作為痛風性關節炎的腫脹度。通過造模小鼠在治療前后各組關節腫脹的變化，進行組間差異性比較。

2.4體外XOD活性抑制實驗篩選藥效部位群

2.4.1酶活性測定參照Cos等[9]描述方法略作修改，用分光光度法在 290 nm 處測定尿酸光密度值以確定XOD活力。反應溫度25℃，總反應體系3mL(包括含1 mM/L EDTA 的0.05 mol/L pH 7.5PBS緩沖溶液、0.15mM黃嘌呤底物溶液、0.02 U XOD)，以緩沖液調零,磷酸鹽緩沖液1 mL和2 mL黃嘌呤溶液作為空白對照組；以pH7.5的磷酸鹽緩沖液0.9ml和2ml黃嘌呤溶液，加入0.2 U/mL XOD 0.1 mL，混勻,作為正常組。測定前先在恒溫水浴鍋中25℃孵育10min，加酶開始啟動反應，立即計時，測定290nm處吸光度增加值 ，每隔30s記錄一次，共測1.8min，得到一條關于吸光度與時間的直線，計算直線斜率 Rate( dmA /min)。

2.4.2樣品抑制XOD測定各藥效部位凍干粉,分別用DMSO溶解成50ug/uL作為樣品液， 用于XOD活性測定。參照步驟2.4.1方法，在酶反應體系中加入0.05mL 200ug/mL的樣品，測定290nm處吸光度增加值 ，計算直線斜率 Rate( dmA /min)。每個樣品平行操作 3 次，取斜率平均值計算樣品的抑制率。在酶反應體系中加入0.05mL 不同濃度的樣品，測定不同濃度樣品對XOD抑制率，以計算樣品的IC50。

2.4.3茶樹根總黃酮和總皂苷對XOD抑制作用類型的初步判斷分別配制不同樣品濃度的茶樹根總黃酮和總皂苷溶液(100,400μg/mL,)，和不同濃度的底物黃嘌呤(濃度分別為0.01,0.02,0.03,0.05,0.1mmol/L)，參照2.4.1方法，將測定樣液在恒溫水浴鍋中孵育10min后，加酶啟動反應，計時1.8min，測定在290nm處的吸光度變化的直線斜率，以直線斜率的倒數對底物濃度的倒數作圖，即雙倒數作圖法判斷茶樹根總黃酮和總皂苷的抑制類型。

3結果

3.1茶樹根藥效部分總黃酮和總皂苷含量采用標準曲線對照法，以蘆丁為標樣,用亞硝酸鈉硝酸鋁顯色法測定茶樹根30%和70%乙醇洗脫部分的總黃酮含量，以熊果酸為標樣,采用香草醛-冰醋酸顯色法測定茶樹根30%和70%乙醇洗脫部分的總皂苷含量。結果表明茶樹根30%洗脫部分為茶樹根總黃酮部分，茶樹根70%洗脫部分為茶樹根總皂苷部分。結果見表1。

表1茶樹根30%和70%乙醇洗脫部分總黃酮和總皂苷含量

樣品總黃酮含量/%總皂苷含量/%30%洗脫部分79.1418.370%洗脫部分4.3862.31

3.2對高尿酸血癥模型小鼠血尿酸的影響與生理鹽水組比較，模型組中血清尿酸顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，茶樹根總黃酮顯著降低血清尿酸水平(P<0.01)。茶樹根總黃酮和總皂苷組之間有顯著差異(P<0.05)，而別嘌呤醇組顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平(P<0.001)，能降至正常值以下，結果見表2。

3.3對高尿酸血癥模型小鼠尿尿酸的影響與生理鹽水組比較，模型組中尿尿酸顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，茶樹根總黃酮顯著增加尿尿酸水平(P<0.01)。茶樹根總黃酮和總皂苷組之間有顯著差異(P<0.01)，茶樹根總皂苷組和別嘌呤醇組幾乎不能增加高尿酸血癥小鼠尿尿酸水平，結果見表2。

3.4對高尿酸血癥模型小鼠血清XOD活性的影響與生理鹽水組比較，模型組中血清XOD活性顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，茶樹根總黃酮顯著降低血清XOD活性(P<0.05)。茶樹根總黃酮和總皂苷組之間有顯著差異(P<0.05)，別嘌呤醇組可極顯著降低高尿酸血癥小鼠血清XOD活性水平，結果見表3。

組別劑量/g·kg-1 血清尿酸水平/mg·L-1尿尿酸水平/mg·L-1生理鹽水組- 56.09±6.02** 103.87±13.15**模型組-78.69±5.63118.27±25.25茶樹根總黃酮組0.548 68.07±8.73**△ 126.06±23.14**△△茶樹根總皂苷組0.54877.93±7..18103.43±31.18別嘌呤醇組0.01 41.56±3.13***116.32±26.13

注：與模型組比較*P<0.05 ，**P<0.01 ，***P<0.001；茶樹根藥效部位組間比較△P<0.05，△△P<0.01。

3.5茶樹根對痛風性關節炎小鼠的影響模型組與生理鹽水組比較有顯著差異(P<0.01),與模型組相比，茶樹根總皂苷在不同時間點(3、5 h)對尿酸鹽誘導的小鼠足腫脹有顯著抑制作用(P<0.01)，而茶樹根總黃酮則抑制腫脹作用較弱(P<0.05)。說明茶樹根總皂苷對小鼠痛風性關節炎有顯著拮抗作用，結果見表4。

組別劑量/g·kg-1血清XOD活力水平/U·L-1生理鹽水組- 30.08±3.91**模型組-39.46±9.46茶樹根總黃酮組0.548 38.52±4.26*△茶樹根總皂苷組0.54840.04±4.31別嘌呤醇組0.01 26.3±3.33**

注：與模型組比較*P<0.05 ，**P<0.01；茶樹根藥效部位組間比較△P<0.05。

表4　茶樹根各藥效部位對痛風性關節炎小鼠模型的影響±s,n=10)

注：與生理鹽水組比較：△△P<0.01；與模型組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3.6茶樹根各藥效部位對XOD的抑制率和IC50根據公式: 抑制率=[(Rp一Rs)/Rp]×100% 計算樣品對 XOD 的抑制率。式中Rs、Rp分別代表樣品、對照 (無樣品)的直線斜率。按照抑制率的計算，底物濃度為0.15mmol/L，樣品濃度均為200μg/mL，別嘌呤醇濃度為5μg/mL，得到抑制XOD能力較強的藥效部位為茶樹根總黃酮。以樣品濃度為自變量，抑制率為因變量，采用SPSS 19.0統計軟件包計算回歸方程,根據回歸方程計算XOD抑制率為5O%的樣品濃度即IC50，抑制率和IC50實驗結果如表5所示。

表5　茶樹根各藥效部位對XOD的抑制效果(n=3)

3.7茶樹根總黃酮對XOD抑制作用機制的判斷

由圖1可知，以直線斜率的倒數對底物濃度的倒數作圖，即雙倒數作圖，不同濃度的茶樹根總黃酮進行雙倒數作圖所得到的雙倒數直線，各直線有交點，但各直線的交點均未在坐標軸上，最大反應速度Vmax 和Km值均隨茶樹根總黃酮濃度的變化而改變，說明茶樹根總黃酮對XOD的抑制作用既不是競爭性也不是非競爭性，由此初步判斷茶樹根總黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制作用可能是混合性的。

圖1　茶樹根總黃酮對XOD抑制機制

4討論

茶樹根中主要含總黃酮和總皂苷類成分，制備茶樹根總黃酮和總皂苷進行體內外抗痛風作用實驗篩選，實驗結果表明茶樹根總黃酮在降尿酸和抑制黃嘌呤氧化酶活性上均起主要作用，茶樹根總黃酮能顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平(P<0.01)和顯著增加尿尿酸水平(P<0.01)以及顯著降低血清XOD活性(P<0.05)。在體外抑制XOD作用中，茶樹根總黃酮呈現一定的抑制XOD作用，這與黃酮類具有黃嘌呤氧化酶抑制作用[9]相符。茶樹根總黃酮IC50為354.72±0.72μg/mL，抑制XOD類型初步判斷為混合型抑制劑。茶樹根總皂苷對尿酸鹽誘導的小鼠足腫脹有顯著抑制作用(P<0.01)。因此茶樹根總黃酮有促進尿酸排泄和抑制黃嘌呤氧化酶活性作用，茶樹根總皂苷對急性痛風性關節炎起主要抑制作用；茶樹根總黃酮和總皂苷均為茶樹根抗痛風的藥效部位群。

本實驗中，雖然茶樹根總黃酮抑制XOD 的作用弱于別嘌呤醇，別嘌呤醇可極顯著降低高尿酸血癥小鼠血清XOD水平(P<0.001)。體外抑制XOD IC50為1.17±0.05μg/mL。但茶樹根總黃酮除了直接抑制XOD活性外，還可以促進尿酸排泄，別嘌呤醇則不能增加尿酸排出。同時總黃酮具有抗氧化作用，可以清除超氧離子等自由基作用[10]。因此茶樹根總黃酮抗痛風作用是較全面的和綜合的?？梢姴铇涓雇达L作用是全面而綜合的，茶樹根總黃酮和總皂苷均為茶樹根抗痛風的藥效部位，不同藥效部位抗痛風機制有所不同，本實驗為茶樹根抗痛風臨床研究奠定了基礎。

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Study on the Active Fractions about Anti-gout of Tee Root

YU Xiong-ying1，ZHOU Jun1，CAO Shu-wen2，ZUO Ai-ren1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004 ,China；

2.NanchangUniversity，FoodScienceandTenologyStateKeyLaboury,Nanchang330047,China.

Abstract:Objective：To study the active fractions of tee root about anti-gout by comparative study the effects of total flavonoids and total saponins of tee root on urine uric acid and blood uric acid and serum xanthine oxidase activity in hyperuricemia mice and the effects on acute gouty arthritic mice and the effects on the inhibition on Xanthine oxidase activity of them in vitro.Methods:We injected oxonic acid potassium and uric acid into the abdominal of mice to made the hyperuricemia in mice,and determined serum uric acid and urine uric acid and serum xanthine oxidase activity by spectrometric method.In addition,Monosodium urate crystals were used to establish gouty arthritis model rats,We detected the inhibition of Swelling degree on the right foot pad part of mice.At last ,We determined the Inhibition of the total flavonoids and the total saponin of tee root on xanthine oxidase in vitro by spectrophotometer with enzyme kinetics software in the wavelength of 290nm.Results：The results showed that total flavonoids of tee root could not only reduce the serum uric acid and serum xanthine oxidase activity and increase urine uric acid in hyperuricemia mice,but also inhibit xanthine oxidase in vitro.But total saponin of tea root has few effection on the above bioactivity.On the contrary,total saponin of tea root had much stronger anti acute gout arthritis effect than total flavonoids of tee root.Conclusion：Total flavonoids of tee root and total saponins of tee root are the active fractions about anti-gout of tee root.

Key words:Tee Root；Total Flavonoids；Total Saponins；Anti-gout; Active Fraction

收稿日期：(2015-03-12)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.0

文獻標識碼：A

通信作者:**周軍 ，講師。Tel：(0791)87118921,E-mail:jessechoujun@sina.com。