蟲草菌絲體HPLC指紋圖譜的研究*

*基金項目：十二五重大新藥創制專項 (2011ZX09201-201-30)；江西省高等學校科技落地計劃項目(產學研合作KJLD13061)；江西中醫藥大學研究生創新專項資金項目(JZYC12A01)；江西省研究生創新專項資金項目(YC2013-S238)。

**第一作者：聶鶴云，男，助教。研究方向：中藥新劑型與新技術。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

蟲草菌絲體HPLC指紋圖譜的研究*

*基金項目：十二五重大新藥創制專項 (2011ZX09201-201-30)；江西省高等學校科技落地計劃項目(產學研合作KJLD13061)；江西中醫藥大學研究生創新專項資金項目(JZYC12A01)；江西省研究生創新專項資金項目(YC2013-S238)。

**第一作者：聶鶴云，男，助教。研究方向：中藥新劑型與新技術。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

★聶鶴云1**陳麗華1張清華1朱衛豐1楊明2管詠梅1***(1.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室南昌 330004；2.江西濟民可信金水寶制藥有限公司南昌 330096)

摘要：目的：建立蟲草菌絲體的HPLC指紋圖譜方法，為質量控制提供一定參考依據。方法：以phenomenx.OOG-4435-EO-C18為色譜柱；流動相為甲醇-0.05%磷酸水梯度洗脫，檢測波長為260nm，進樣量為10μL，流速為1.0 mL/min；對指紋圖譜進行相似度評價以及聚類分析。結果：建立蟲草菌絲體的HPLC指紋圖譜，確定9個共有峰；確定其相對保留時間以及相對峰面積的比值，該方法能夠很好的鑒別不同生產廠家蟲草菌絲體產品。結論：該方法精密度、穩定性和重復性良好，可應用于蟲草菌絲體的質量控制。

關鍵詞：蟲草菌絲體；高效液相；指紋圖譜；相似度

冬蟲夏草(cordycepssinensis)，是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體[1]，是一種傳統的名貴滋補中藥材，有調節免疫系統功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。近年來，由于自然環境及開采過度的影響，冬蟲夏草的產量日益減少，無法滿足市場的需要，價格居高不下，目前國內已采用以天然蟲草真菌發酵法獲得人工蟲草菌，并且已經在臨床上廣泛使用。目前市售發酵蟲草菌粉制劑有金水寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊以及至靈膠囊。這5種蟲草菌絲產品中，質量標準載入2010版《中國藥典》的僅有金水寶膠囊、金水寶片及百令膠囊。寧心寶膠囊、心肝寶膠囊、至靈膠囊收載于衛生部頒成方制劑標準中。百令膠囊檢測項包括薄層色譜法檢測麥角甾醇；高效液相色譜法測定腺苷類成分；金水寶片劑及金水寶膠囊劑檢測項包括薄層色譜法鑒別腺嘌呤、腺苷、尿苷成分；高效液相色譜法測定腺苷含量。此類檢測雖能對蟲草菌絲類產品質量進行控制，但卻難以區分類似產品。為了避免單一成分控制產品質量的不足[2]，本實驗采用HPLC指紋圖譜對蟲草菌絲類產品進行研究，通過相似度評價，聚類分析較為全面地鑒別不同廠家蟲草菌絲體。

1儀器與材料

1.1儀器 GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)，Agilent1260型高效液相儀(美國安捷倫)，KQ3200E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。BT25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2材料 百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司)，寧心寶膠囊(正大青春寶藥業有限公司)，至靈膠囊(大同市利群藥業有限責任公司)，心肝寶膠囊(長天藥業)，金水寶膠囊(江西濟民可信集團有限公司)，見表1。

尿苷對照品(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號：1065-101017)，鳥苷對照品(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號：1081-110401)，腺苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110879-200202)，染料木素(南昌貝塔生物科技有限公司,批號：10362-201211)，麥角甾醇(南昌貝塔生物科技有限公司，批號：20042-201202)，大豆素、黃豆黃素對照品自制，質量分數大于99%；乙腈色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

表1　樣品來源

2實驗方法與結果

2.1供試品的制備精密稱取金水寶、百令膠囊、至靈膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊各1g,分別倒入錐形瓶中，加入甲醇20mL，超聲30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量,搖勻，過0.22μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2混合對照品溶液制備分別精密稱取腺嘌呤、腺苷、尿苷、鳥苷、染料木素、大豆素、黃豆黃素、麥角甾醇5mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，即得100μg/mL的混合對照液，再過0.22μm的微孔濾膜，取續濾液，備用。

2.3方法學考察

2.3.1色譜條件十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為phenomenx.OOG-4435-EO(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇(B)-0.05%磷酸水(A)，梯度洗脫：0～10min，5%B；10～20min，5%～30%B；20～60min，30%～100%B；60～70min，100%B； DAD檢測器，體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10μL。

2.3.2精密度實驗精密稱取金水寶膠囊樣品(130907)，按照2.1項下的方法的處理，在2.3.1項的色譜條件下進樣，連續進樣5次，結果表明共有峰相對保留時間RSD在0.34%～1.22%，共有峰相對峰面積>5%的峰面積值RSD在0.56%～1.45%，符合指紋圖譜標準，精密度良好。

2.3.3重復性實驗取同一批次的樣品，按照2.1項下的方法制備6份供試品，在2.3.1項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，結果表明共有峰相對保留時間RSD在0.26%～1.08%，共有峰相對峰面積RSD在0.79%～1.88%，符合指紋圖譜標準，重復性良好。

2.3.4穩定性試驗取同一批次金水寶膠囊(130907)新制備的供試品于0、2、4、8、12、24h進樣HPLC分析，結果表明共有峰相對保留時間RSD在0.45%～1.65%，共有峰相對峰面積RSD在0.62%～1.67%，符合指紋圖譜標準，表明各成分在24h穩定。

圖1　蟲草菌絲體共有峰模式

2.4蟲草菌絲體指紋圖譜的確立[3-5]

2.4.1蟲草菌絲體共有峰的確立按上述液相色譜條件測定了 15份蟲草菌絲體藥品(表1中的1～ 12號樣品),采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統( 國家藥典委員會，2004B版) 對12批次樣品色譜圖進行分析，確定了9個共有峰，共有峰保留時間分別為2.52、3.17、3.56、4.51、6.10、7.85、14.85、64.95、69.90min，結果見圖1。選取9號峰位參照峰，計算蟲草菌絲體其他共有峰相對保留時間、相對峰面積，結果見表 2、3。

表2　12批蟲草菌絲體共有峰相對保留時間

表3　12批蟲草菌絲體共有峰相對峰面積

2.4.2不同廠家蟲草菌絲指紋圖譜比較在相同的液相條件下分析5個不同產家12批蟲草菌絲體產品,通過比較5種不同廠家的蟲草菌絲體HPLC圖譜，發現不同種類的蟲草菌絲體化學成分有一定的差異，5種蟲草菌絲體中除寧心寶膠囊不含4、8號峰外，其余的都含上述8種化學成分，此外金水寶膠囊、至靈膠囊、心肝寶膠囊還含大豆素、黃豆黃素、染料木素，而百靈膠囊、寧心寶膠囊未檢測出這些成分，見圖3。

2.5聚類分析以 12批不同生產廠家的蟲草菌絲體為研究對象，進行指紋圖譜研究，得到9個共有色譜峰，將至靈膠囊9號作為參比峰，其他色譜峰相對于至靈膠囊9號峰的峰面積量化，得到原始數據作為聚類分析的指標，采用SPSS統計軟件進行分析，聚類分析圖見圖4。從圖4可以看出S1、S2為一類，為百令膠囊，S3、S4為一類，為寧心寶膠囊，S5、S6、S7為一類，為至靈膠囊，S8、S9為一類，為心肝寶膠囊，S10、S11、S12為一類，為金水寶膠囊。這與實際情況相符合，說明該方法可以很好的鑒別不同種類的蟲草菌絲體，可以作為一種蟲草菌絲體質量控制的手段。

圖2　蟲草菌絲HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3　12批樣品峰面積聚類分析圖

3討論

3.1不同提取方式得選擇實驗考察了冷凝回流提取、冷浸提取、超聲波提取三種提取方式，結果發現超聲提取化學成分多、操作簡單方便、效率高、因此采用超聲波提取供試品。

3.2不同提取溶劑測選擇實驗比較了水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、純甲醇作為提取溶劑，結果表明甲醇作為提取溶劑、所得的峰多，且分離效果較好，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3檢測波長的選擇本實驗采用DAD檢測器，對發酵蟲草菌粉色譜圖在200～400nm波長范圍內全波長掃描，結果發現260nm，基線最平穩，且主要化學成分峰也最高，因此確定260nm作為檢測波長。

3.4流動相的選擇蟲草菌絲類所含化學成分復雜，且各種類型的化合物的極性差別較大，考察了等梯度甲醇-水系統、乙腈-水系統、及甲醇-0.05%磷酸水系統、乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度系統，結果發現，甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度系統，基線最平穩，且分離較好，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫。

3.5建立指紋圖譜的意義本實驗建立的蟲草菌絲指紋圖譜，能夠使蟲草菌絲體共有成分以及各蟲草菌絲體特有成分在色譜圖中體現，從而化學成分的角度反映不同生產廠家蟲草菌絲整體化學信息，因此可作為一種鑒別不同廠家生產的蟲草菌絲體方法，所建的指紋圖譜具有良好的穩定性和可控性，因此也可以作為蟲草菌絲產品內在質量控制的一種有效方法。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010:106.

[2]武彥舒，周丹蕾，鄢 丹,等. 天然蟲草與蟲草菌絲體的HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥，2008,33(19)：2 212-2 214.

[3]蘇穎，李競.人工蛹蟲草HPLC指紋圖譜的建立[J].亞太傳統醫藥，2012, 8(3):10-11.

[4]祝明，金樟照，陳勇，等. 百令膠囊的指紋圖譜鑒別研究[J].中成藥，2007,29(9)：1 254-1 256.

[5]郝子博，王麗莉，張鐵軍. 落花生莖葉HPLC 指紋圖譜研究[J].中草藥，2012,43(10)：2 050-2 052.

HPLC Fingerprint Analysis of Mycelium of Cultured Cordy

NIE He-yun1,CHEN Li-hua1,ZHANG Qing-hua,ZHU Wei-feng1, YANG ming2, GUAN Yong-mei1

1.KeyLaboratoryforModernPreparationofTraditionalChineseMedicine,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiJimingkexinJinshuibaoCo.Ltd,Nanchang330096,China.

Abstract:Objective：To establish HPLC fingerprints of mycelium of cuhured cordy for qualitycontrol.Method:HPLC method was used for the determination of phenomenx.OOG-4435-EO-C18column(250mm×4.6mm,5μm)and methanol-0.05%H3PO4in gradient ehtion as a mobile phase，the detection wavelength was 260nm，injection sample of 10μL and flow rate of 1.0mL/min；The similarity of fingerprints was evaluated，then，duster analysis was studied.Result: HPLC fingerprint of cordyceps Mycelial was established，nine common peaks were selected as the fingerprint peaks of cordyceps Mycelial；The relative retention time and the ranges of relative area of the common peaks were determined，cordyceps Mycelial from different production of producers and could be distinguished by the HPLC fingerprint.Conclusion:The method has desirable precision，reproducibility and stability，it can be applied to the quality control of cordyceps Mycelial.

Key words:Cordyceps Mycelial；HPLC；Fingerprint；Similarity

收稿日期：(2015-05-14)編輯：翟興英

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：B

通信作者：***管詠梅，女，副教授，碩士生導師。研究方向：中藥新劑型與新技術。Tel:0791-87118614，E-mail: guanym2008@163.com。