溫腎活血化濕方對腎間質纖維化大鼠腎組織TGF-β1、sm ad7蛋白表達的影響*

李建省，王寶蕊

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州730050

腎間質纖維化（RIF）是幾乎所有慢性腎臟疾病發展至終末期腎臟病的最后共同通路。RIF主要病理改變為大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增生，細胞外基質產生和堆積導致腎小管間質纖維化、腎小球硬化，最終導致腎功能衰竭。目前，針對腎間質纖維主要采取抑制或清除促纖維化因子方法，轉化生長因子β（TGF-β）是腎間質纖維化發生、發展的關鍵因子。目前所知smads蛋白是TGF-β受體唯一的胞內信號傳導，TGF-β/smad信號傳導通路是RIF主要的最終共同通路。因此，阻斷腎間質纖維化某些關節環節，可能阻止腎纖維化的發生、發展從而達到治療慢性腎臟病治療目的。在前期的臨床研究中我們發現溫腎活血化濕方具有改善腎功能，降低尿蛋白，延緩慢性腎功能衰竭的功效。本研究利用UUO法復制腎間質纖維化大鼠模型，觀察溫腎活血化濕方對其腎組織結構及 TGF-β1，smad7蛋白表達的影響，初步探討其對該模型大鼠腎組織TGF-β/smad信號傳導通路的影響及其防治腎間質纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 氯沙坦（杭州默沙東公司生產，國藥準字：J20B0148）。TGF-β1，smad7(兔抗大鼠多克隆抗體)、免疫組化二抗及DAB試劑盒（武漢博士德）。溫腎活血化濕方（藥物組成：黃芪30 g，川芎10 g，續斷10g，牛膝10g，菟絲子30g，桂枝30g，白豆蔻10 g）。

1.2 動物分組及給藥 清潔級3～4周齡雄性SD大鼠120只，體質量180～210 g，蘭州大學醫學院動物中心提供，醫學動物合格證號 SCXK（甘）2009-0004，參照文獻[1]方法采用單側輸尿管結扎手術(UUO法)建立腎間質纖維化大鼠模型，隨機分為假手術組、UUO組、溫腎活血化濕方組、氯沙坦組，每組20只。以5%水合氯醛腹腔注射麻醉，從右側旁正中切口剪開腹壁，暴露右側輸尿管，結扎右側輸尿管，關閉腹腔。假手術組只分離但不結扎輸尿管。術后第2天給藥，假手術組、UUO組給予相應生理鹽水，氯沙坦組灌胃給予氯沙坦（10mg·kg-1·d-1）混懸液，溫腎活血化濕方組給予溫腎活血化濕方（我院制劑室經水煮提取，含生藥2 g/mL，按換算系數換算成大鼠灌胃給藥）水煎液(9.8 g·kg-1·d-1)。術后第 7、14、21天每組處死10只大鼠，切除右腎，腎組織部分行甲醛固定、脫水后包埋備用，其余液氮中保存備用。

1.3 觀察指標

1.3.1 考馬斯亮藍法測定尿蛋白定量 第7、14、21天分別用代謝籠收集大鼠24小時尿液，用考馬斯亮藍法測定24小時尿總蛋白定量。

1.3.2 腎組織病理檢測 取右側腎組織切片，進行蘇木素-伊紅（HE）、Masson染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態結構變化情況

1.3.3 腎組織TGF-β1、smad7蛋白表達 按照兩步法免疫組化檢測試劑盒(HRP-多聚體抗兔)操作步驟進行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復染，光鏡下觀察腎組織TGF-β1、smad7蛋白的表達。光鏡下細胞核、細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性信號。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析免疫組化圖片。根據累計吸光度（A）與面積之比值，選取10個不重疊視野，計算單位面積陽性染色區域的平均A進行統計學分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料用(χ±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 24小時尿總蛋白定量 與模型組相比較，造模后第14天溫腎活血化濕方尿蛋白定量明顯降低（P＜0.05）,第21天溫腎活血化濕方與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠24小時尿總蛋白定量(χ±s)mg/24h

2.2 大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達 與模型組比較，假手術組大鼠在第7、14、21天腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1蛋白表達增多（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、纈沙坦組與模型組相比較TGF-β1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠腎組織smad7蛋白表達 與模型組比較，假手術組大鼠在第7、14、21天腎組織smad7蛋白表達升高（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、氯沙坦組與模型組相比較smad7蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達的比較(χ±s)

表3 各組大鼠腎組織smad7蛋白表達的比較(χ±s)

3 討論

腎間質纖維化是慢性腎臟病最終的共同通路。TGF-β1誘導肌成纖維細胞激活并導致細胞外基質生成，進而導致腎纖維化和腎小管萎縮[2]。因此，抑制TGF-β1誘導的肌成纖維細胞活化是抑制腎間質纖維化的治療策略。目前，腎間質纖維化動物模型有UUO、5/6腎切除(subtotal nephrectomy，STNx)、環孢素A腎病等多種模型。UUO模型是研究腎小管間質纖維化公認的模型。輸尿管結扎導致腎間質纖維化，引起腎臟彌漫性損害[3-4]。

腎間質纖維化屬于中醫學“關格”“溺毒”“水腫”“虛損”等范疇。劉玉寧認為“虛、痰（濁）、瘀、毒”是導致腎間質纖維化發生、發展之關鍵。樊均明以“腎痿”立論。王獻耀教授提出“腎絡微型癥瘕”是腎纖維化的中醫病機[5]。益氣活血化濁、補腎活血、溫陽法為其治療大法[6]。我們認為虛、瘀、痰濕是導致慢性腎臟病腎間質纖維化發生、發展之關鍵。腎虛為本，痰（濁）、瘀為標，毒是加重腎間質纖維化不可忽視的方面。在慢性腎臟病4～5期，以脾腎陽虛為主，我們認為腎陽虛腎絡瘀阻為腎間質纖維化主要病機，因此我們用溫腎活血化濕法治療慢性腎臟病臨床效果滿意。溫腎活血化濕方由黃芪、川芎、紅花、續斷、牛膝、菟絲子、淫羊藿、桂枝、干姜、白豆蔻、白芷組成，具有溫腎活血，健脾化濕之功效，為治療慢性腎臟病有效方劑。已有研究證實，黃芪、川芎能調節細胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能。通過下調TGF-β表達，抑制腎小管轉分化、下調ECM的主要成分、下調CTGF表達等多途徑多靶點抑制腎小管上皮細胞增殖，抑制腎小管上皮細胞轉分化，改善腎間質纖維化[7]。補腎益氣法能抑制成纖維細胞過度活化，促進其凋亡[8]。補腎活血中藥可以加速細胞外基質降解，減少細胞外基質積聚，從而防治腎小球硬化[9]。益氣活血方通過下調TGF-β、上調smad7的表達來遏制腎纖維化的進展[10]。

本研究結果表明，溫腎活血化濕方具有降低模型大鼠尿蛋白作用，通過減少TGF-β1表達，上調smad7蛋白表達，減輕腎間質纖維化，為進一步研究該治法及其方藥提供實驗依據。

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