楊樹嫩莖質外體中脯氨酸含量測定方法的建立

馬金龍，姜國斌，金 華，郭 鵬，吳 懿

(大連民族學院a. 生命科學學院;b.環境與資源學院，遼寧 大連116605)

Kemble 和Macpheson 在研究黑麥時發現，干旱條件下游離脯氨酸大量積累［1］，脯氨酸在滲透調節方面發揮著細胞質滲透調節物質和防脫水劑的作用。從遺傳角度看，植物的抗滲透脅迫功能是一種數量性狀，是由多種基因控制的綜合反應，脯氨酸積累只是植物細胞對滲透脅迫反應的一種［2］。將脯氨酸作為一種滲透保護劑的觀點是由Csonka 等在研究細菌抵抗滲透脅迫時提出的［3］。Handa 等 和Rhodes 等 都曾報道過馬鈴薯培養細胞在滲透脅迫下能迅速積累脯氨酸，培養細胞對滲透脅迫表現出較強的適應能力［4－5］。植物的組織、器官和全株試驗中，同樣也發現了眾多的事例說明脯氨酸的積累與抗滲透脅迫之間有顯著的正相關［6］。

在滲透脅迫條件下，植物中有10 類基因被誘導表達，產生的物質與植物抗脅迫密切相關［7］。脯氨酸能夠穩定蛋白質或通過滲透調節維持細胞膨壓或氧化還原代謝恢復細胞的氧化還原平衡，研究植物抗逆性時，也是重要的研究指標［8］。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸［9］，也是抗滲透壓的小分子物質。在發生干旱、鹽漬時，植物周圍環境滲透壓發生變化，大部分植物會積累大量的脯氨酸，從而抵制高滲環境對植物生存和生長的影響［10－12］。

植物質外體是溶質和水分運輸、信號轉導、抵抗逆境等許多重要生理生化過程的動態空間，植物質外體各項指標的研究技術和方法亟待解決和突破。本研究在前期建立的植物嫩莖質外體汁液微透析技術以及對鹽脅迫下楊樹嫩莖質外體離子等的微透析和光合生理影響研究的基礎上，建立了微透析嫩莖質外體中脯氨酸含量鑒定體系，進而實現植物質外體滲透脅迫生理機制研究技術和理論的創新。

1 材料與方法

1.1 材料

盆栽試驗所采用的“吳屯楊”(Populus wutunensis)、“歐美楊”(中荷64)(P. euramericana)及“小美旱楊”［P. simonii ×(P. pyramidalis +Salix matsudana)］由遼寧省阜新縣林業局提供。在4月上旬進行插條盆栽(內徑20 cm、高16 cm)，每隔5 ～7 d 澆0.5 L Hoagland 營養液1 次，注意防雨及植株病蟲害防治。微透析MD 取樣后進行高效液相色譜HPLC 分析，每個樣品均重復3 次。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(日本島津，LC －20A)，配有LC－20AT 泵、LC－20AB 二極管陣列檢測器和島津液相色譜工作站，島津Inertsil ODS －SP 色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)，柱溫31℃，流動相A:0.05 mol·L－1醋酸鈉溶液，流動相B∶乙腈－流動相A(1∶1)，洗脫條件:A∶B(50∶50)，流速:1.0 mL·min－1，檢測波長:254 nm，進樣量20 μL［13］;微透析MD 儀(瑞典CMA －400);微透析微量注射泵(美國BASi)。

1.3 相關標準溶液的配制［14］

(1)儲備液配制:取脯氨酸標準品(上海生工)適量，精密稱量，加0.1 mol·L－1的鹽酸溶液制成每1 mL 含脯氨酸0.1 mg 的溶液，即為對照品儲備液。

(2)標準液:精密量取儲備液1 mL，置于10 mL 玻璃試管中，精密加入1.2 %苯異硫氰酸酯PITC －乙腈溶液及14 %的三乙胺－乙腈溶液各2 mL，漩渦混勻1 min，室溫放置20 min 后，加入正己烷15 mL 萃取，精密移取下層液4 mL，置于5 mL 容量瓶中，用流動相A 定容，經微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得標準液。

(3)空白液:取0.1 mol·L－1的鹽酸溶液置于10 mL 玻璃試管中，后續步驟同(1)。

1.4 植物質外體透析液樣品的獲取

微透析體系由導引管、微透析探針、連接管、灌注介質、微量注射泵和樣品收集器組成。由于楊樹莖組織相對動物組織較硬，為防止損傷探針，先用導引管插入幼嫩莖的取樣部位，然后再植入探針。探針與嫩莖呈30° ～45°角植入。為防止灌流液損失和探針脫落，采用牙托水(取少許自凝粉，吸取適量義齒基托樹脂液劑攪拌至黏糊狀)將探針插入部位密封好;灌流速度為1 μL·min－1，灌流液為Millipore－Q 超純水。選取截留量為30 kD 的探針［15］。

1.5 微透析探針體外回收率和加標回收率的測定

體外相對回收率:在與微透析取樣楊樹嫩莖相同的條件下，將微透析探針放入已知濃度的脯氨酸標準液中進行取樣，每次取樣前平衡30 min。測定質量濃度與標準液質量濃度之比就是體外相對回收率。試驗重復3 次，得到的體外相對回收率為9.5 %。

汁液濃度計算公式:

式中，C 為質外體汁液中某離子濃度，C1 為原子吸收分光光度計測定的質量濃度值，10 為稀釋倍數，0.095 為體外相對回收率。

加標回收率:將微透析儀速度設為1 μL·min－1，選取吳屯楊嫩莖進行微透析取樣，獲取4份透析液待測。在每份透析液中準確吸取300 μL于4 支小離心管內，分別加入一定體積的標準溶液。測定脯氨酸質量濃度，根據測定結果換算成透析液中加標前后脯氨酸的質量值。重復3 次，計算加標回收率。

1.6 數據處理及分析

試驗數據用Excel 2007 預處理后，采用SPSS17.0 軟件進行分析，Sigma plot10.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 脯氨酸標準品定性分析

脯氨酸標準品的HPLC 圖譜如圖1，60 μL 透析液中脯氨酸HPLC 圖譜如圖2。從兩圖中可以看出，二者的脯氨酸出峰時間均為20.8 min，峰形尖銳，表明60 μL 微透析樣品完全可以檢出脯氨酸。

圖1 標準方法衍生化脯氨酸HPLC 圖

圖2 60μL 標準品透析液中脯氨酸HPLC 圖

2.2 標準曲線及檢出限的測定

為了繪制脯氨酸標準曲線，配制10 mg·L－1脯氨酸的儲備液，分成5 個質量濃度梯度，標準溶液在確定的色譜條件下分別進樣。以峰面積為縱座標，以進樣質量濃度為橫座標，將相關數據輸入Excel 2003 進行運算，得到脯氨酸的線性回歸方程及其相關系數(見表1)。從表1 可以看出，各標樣溶液的質量濃度與其峰面積線性關系良好，相關系數在0.998 5 ～1.000 0。

表1 脯氨酸的線性回歸方程數據

根據以上色譜條件作標準曲線(如圖3)，可以看出，脯氨酸質量濃度和峰面積呈現良好的線性關系。

圖3 脯氨酸標準曲線

2.3 透析液脯氨酸樣品的測定

取透析液60 μL，置于0.5 mLTube 管中，加入0.1 mol·L－1PITC － 乙腈溶液25 μL，1.0 mol·L－1三乙胺－ 乙腈溶液25 μL，混勻，室溫放置1 h 后，加50 % 乙腈溶液100 μL，混勻，加入正己烷100 μL，漩渦混勻1 min，放置10 min，取下層溶液，即得標準液。所用試劑和超純水均經過微孔濾膜(0.45 μm)濾過。同時需要配制空白液:取0.1 mol·L－1的鹽酸溶液置于0.5 mL Tube 管中，后續步驟同透析液衍生化方法。

將微透析樣品在確定的色譜條件下直接進樣，測得的峰面積代入回歸方程計算出測定值，再依據探針的體外回收率對測定值進行修正。試驗過程中每隔60 min 收集透析液進一次樣，透析液樣品色譜如圖4。3 種楊樹(吳屯楊、歐美楊、小美旱楊)的微透析液中脯氨酸的測定結果見表2。

圖4 3 種楊樹透析液中脯氨酸紫外吸收圖譜

表2 3 種楊樹透析液中脯氨酸質量濃度 mg·L －1

2.4 透析液樣品加標回收率的測定

透析液樣品加標回收率試驗結果見表3。

表3 脯氨酸加標回收結果

3 結論與討論

脯氨酸是抗滲透壓的最重要的小分子物質之一，在發生干旱、鹽漬時，植物周圍環境滲透壓明顯發生變化，而大部分植物會積累大量的脯氨酸，抵制高滲環境對植物生存和生長的影響。傳統的試驗方法選取植物部分組織破碎后再提取脯氨酸，一方面破壞了植株，無法進行持續研究;另一方面只能測得部分組織中脯氨酸的含量［9，12］。本研究采取微透析法，完全克服了這些缺點，而且可以精準定位質外體中的脯氨酸，還可以在以后的逆境脅迫研究中，與脅迫同步進行楊樹質外體中脯氨酸含量變化研究，保證研究的準確、及時和定位。因微透析法本身就是對樣品的一種高倍數稀釋，雖然透析液中脯氨酸含量較少，但通過衍生化方法［14］，再結合高精度的HPLC 儀器，完全可以準確檢測楊樹嫩莖質外體中脯氨酸的含量。

微透析取樣樣品量少，衍生化是一個難點。本研究最終確定，樣品體積為60 μL 時進行衍生化可得到較好的結果。從研究結果可以看出，通過微透析取樣，將樣品進行PITC 衍生化，得到吳屯楊、歐美楊和小美旱楊3 種楊樹嫩莖脯氨酸的質量濃度分別為0.341，0.365，0.254 mg·L－1，結果可靠，重復性好。試驗證明，微透析法是研究植物抗逆生理的有效方法。

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