RNA干擾Fbxw8基因對人結腸癌細胞增殖能力的影響

馮金發 戴 猛 張浩梁 金龍 楊 勇 楊澤利 孫 侃

黑龍江省醫院普外科，黑龍江哈爾濱150000

RNA干擾Fbxw8基因對人結腸癌細胞增殖能力的影響

馮金發 戴 猛 張浩梁 金龍 楊 勇 楊澤利 孫 侃▲

黑龍江省醫院普外科，黑龍江哈爾濱150000

目的探討靶向抑制Fbxw8基因對結腸癌SW 480細胞增殖的影響。方法RNA干擾（RNAi）方法下調SW 480細胞中Fbxw8的表達。通過Real-time PCR、western blotting方法分別檢測Fbxw8mRNA和蛋白表達變化；CCK-8、細胞克隆形成實驗及BrdU摻入法檢測下調Fbxw8對SW 480細胞的增殖、DNA合成能力的影響。Western blotting檢測下調Fbxw8對SW480細胞增殖相關基因表達的影響。結果Fbxw8 siRNAs顯著降低SW480細胞Fbxw8 mRNA和蛋白的表達，CCK-8結果顯示：與對照組（0.78±0.11）相比，兩對Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制細胞的生長（0.46±0.07、0.49±0.03，P＜0.05）；細胞克隆形成實驗顯示與對照組相比，Fbxw8 siRNAs組細胞的克隆形成數目及大小顯著降低。BrdU摻入實驗顯示與對照組（0.83±0.12）相比，Fbxw8 siRNAs均能顯著下調DNA的合成能力（0.47±0.06、0.56±0.09，P＜0.05）；同時伴隨著細胞周期蛋白cyclin E的下調而p27的表達升高。結論Fbxw8 siR NA可以通過下調cyclin E、上調p27的表達而有效抑制SW480細胞增殖，為結腸癌的基因治療提供新的候選靶點。

結腸癌；SW 480；Fbxw8；細胞增殖；Cyclin E；p27

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，每年在世界范圍內占新發腫瘤的第3位[1]。近年來，我國的發病率也呈逐年上升的趨勢[2]。大多數結腸癌患者就診時已有轉移病灶，術后必須輔以化療。但迄今為止，由于結腸癌細胞對化療藥物易產生耐藥性，而使大多數化療藥物的療效有限。因此臨床上急需尋找結腸癌基因治療的靶點。腫瘤細胞的惡性增殖在癌癥進程過程中具有重要作用，而結腸癌細胞的惡性增殖機制目前尚不完全明確[3]。Fbxw8作為F-box蛋白，可與Skp1、Cullin7及ROC1形成CUL7/Fbxw8 E3連接酶，特異性識別并降解胰島素受體底物-1（IRS-1），從而成為調控生長的重要分子[4-7]。研究表明，下調Fbxw8表達可顯著抑制絨癌細胞JEG-3及胰腺癌細胞的增殖功能，但Fbxw8對結腸癌細胞增殖功能的影響未見報道[8]。本研究將以結腸癌細胞SW480為研究對象，通過靶向抑制此細胞中Fbxw8的表達，觀察Fbxw8對SW480細胞增殖的影響，闡明Fbxw8對結腸癌細胞SW 480細胞增殖的影響之一是通過調控細胞增殖相關分子cyclin E和p27基因表達實現的。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株SW480購自ATCC，RPMI1640液體培養基及胎牛血清為Gibco公司產品，Cell Counting Kit-8為日本株式會社同仁化學研究所產品；BrdUrd試劑盒購自Roche公司，Fbxw8 siRNA，lipofectamineTM2000，Trizol為Invitrogen公司產品，逆轉錄、real-time PCR反應系統、SYBY熒光定量試劑盒購于TakaRa公司，基因引物為上海生工生物工程有限公司提供，Fbxw8抗體為Abcam公司產品、cyclin E抗體、p27抗體、β-actin抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP及western blotting相關試劑購于普利萊公司。Invitrogen公司設計合成為2對由25個堿基組成的Fbxw8 StealthTM siRNA序列：Fbxw8 siRNA1：5′-CCGAAACUGGUUCAGUACCUUGAAA-3′；Fbxw8 siRNA2：5′-CAGUAGCAGCUUAUGAGGAUGGGUU-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染結腸癌SW480細胞常規培養于RPMI1640培養液，其中含有10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL。細胞在37℃、5% CO2培養箱中培養。對數生長期細胞接種于35mm或60 mm培養皿培養24 h，細胞匯合度達到30%～50%時，應用無血清RPMI1640培養液配制終濃度為50 nM的Fbxw8 siRNA，按照Lipo fectamineTM2000說明書進行轉染操作，轉染6 h后棄去轉染液換為正常培養液。細胞轉染實驗分三組：陰性對照組（CTL），Fbxw8 siRNA1組，Fbxw8 siRNA2組。

1.2.2 Rea l-t ime PCR檢測Fbxw8 mRNA表達水平細胞轉染后48 h，應用Trizol提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度。根據逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA后進行real-time PCR反應。檢測Fbxw8的引物序列為：5′-GGATCCAGTAGATGCGTATGG-3′（Forword），5′-CAGGAGTGTCTGGAATTGTC-3′（Reverse）；β-actin的引物序列為：5′-TACCTCATGAAGATCCTCACC-3′（Forword），5′-TTT CGTGGATGCCACAGGAC-3′（Reverse）。反應條件：預變性95℃30 s，然后95℃5 s，60℃30 s，反應40個循環，實驗數據通過CT值法（2-△△CT）進行相對定量分析。

1.2.3 Wes t e r n b l o t檢測Fbxw8蛋白表達水平細胞轉染后72 h，RIPA細胞裂解液抽提各組細胞總蛋白，BCA法定量。12%SDS-PAGE電泳分離蛋白質后將產物轉移到硝酸纖維薄膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗Fbxw8（1∶500）、cyclinE（1∶1 000）、P27（1∶1 000）和β-actin（1∶2000），4℃反應過夜，TBST充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，1∶2000稀釋。室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入發光底物ECL，在暗室內曝光顯影固定。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞存活能力對數生長期SW480細胞以1×103個/孔密度接種于96孔培養板，37℃，5%的CO2中培養過夜，然后分別轉染CTL或Fbxw8 siRNAs。轉染后48 h每孔分別加入10μLCCK8溶液，繼續培養2 h，應用酶標儀于450 nm光波檢測每孔吸光度。

1.2.5 克隆形成實驗對數生長期SW480細胞1×103接種于96孔板中，按前述方法進行細胞轉染。轉染24 h后，消化細胞，分別接種于6孔板中（100個/孔），使細胞分散均勻，將6孔板移到培養箱中，靜置培養2周，直到孔板中出現肉眼可見的克隆時終止培養。應用甲醇溶液固定細胞，結晶紫溶液染色，將6孔板放在倒置光學顯微鏡下觀察結果。

1.2.6 Br dU比色法檢測細胞DNA合成能力對數生長期SW480細胞1×103接種于96孔板中，按前述方法進行細胞轉染。轉染后72 h用BrdUrd標記，37℃孵育3 h；應用試劑盒帶有的緩沖液沖洗3遍；應用抗BrdUrd的抗體在25℃孵育1.5 h；加入substrate solution作用0.5 h；加入封閉溶液（1M硫酸）；應用酶標儀檢測各組細胞的OD450 nm可吸收光度值。

1.3 統計學方法

用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

Fbxw8 siRNAs顯著降低SW480細胞Fbxw8mRNA和蛋白的表達，CCK-8結果顯示：與對照組（0.78± 0.11）相比，兩對Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制細胞的生長（0.46±0.07、0.49±0.03，t=2.532，t=2.643，P＜0.05）；細胞克隆形成實驗顯示：與對照組相比，Fbxw8 siRNAs組細胞的克隆形成數目及大小顯著降低。BrdU摻入實驗顯示：與對照組（0.83±0.12）相比，Fbxw8 siRNAs均能顯著下調DNA的合成能力（0.47±0.06、0.56±0.09，t=2.632，t=2.236，P＜0.05）；同時伴隨著細胞周期蛋白cyclin E的下調而p27的表達升高。

2.1 SW 480細胞中轉染Fbxw8 siRNAs后Fbxw8的mRNA和蛋白的表達

Fbxw8 siRNA 1，2分別轉染SW480細胞。Realtime PCR和western blotting結果表明，與轉染陰性對照（CTL）siRNA細胞相比，兩對Fbxw8 siRNAs都可顯著抑制SW 480細胞中Fbxw8 mRNA及蛋白表達水平（圖1 A、B和C）。

圖1 Real-time PCR和western blotting法檢測轉染Fbxw8siRNAs對Fbxw8 m RNA和蛋白表達的影響

2.2 靶向抑制Fbxw8表達對SW 480細胞生存活力的影響

我們利用CCK-8法檢測下調Fbxw8的表達對SW 480細胞生存活力的影響，結果表明，與對照組相比，兩對Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制SW480細胞的存活能力（圖2）。

圖2 靶向Fbxw8基因siRNAs對SW 480細胞生存活力的影響

2.3 靶向抑制Fbxw8表達對SW 480細胞克隆形成能力的影響

我們利用克隆形成實驗評價下調Fbxw8表達對SW 480細胞增殖能力的影響。結果顯示，與對照組相比，Fbxw8 siRNA轉染組細胞集落顯著減少，而且集落相對較小（圖3）。

圖3 靶向Fbxw8基因siRNAs對SW 480細胞克隆形成能力的影響

2.4 靶向抑制Fbxw8表達對SW 480細胞DNA合成能力的影響

為了進一步探討Fbxw8對細胞增殖的影響，我們利用BrdU摻入實驗檢測下調Fbxw8的表達對SW 480細胞DNA合成能力的影響，結果表明，與對照組相比，兩對Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制SW 480細胞的DNA的合成，從而降低細胞的增殖能力（圖4）。

圖4 靶向Fbxw8基因siRNAs對SW 480細胞DNA合成能力的影響

2.5 靶向抑制Fbxw8表達對SW 480細胞增殖相關基因表達的影響

我們利用western blotting方法檢測下調Fbxw8表達對SW480細胞cyclinE和p27表達的影響。結果表明，與對照組相比，兩對Fbxw8 siRNAs均可降低cyclinE的表達，而p27的表達明顯升高（圖5）。

3 討論

結腸癌作為癌癥相關疾病死亡的主要疾病之一，近年來，我國結腸癌的發病率及死亡率均呈逐年上升趨勢。結直腸癌細胞的增殖在腫瘤進展中具有重要作用，從分子水平探尋癌細胞生長的機制，有助于發現新的治療靶點。

圖5 靶向Fbxw8基因siRNAs對SW 480細胞cyc linE及p27蛋白表達的影響

Fbxw8是SCF-like泛素E3連接酶（SCF Skp1-Cul7-Fbxw8）的重要組分，其可識別并將底物蛋白泛素化，進而泛素化蛋白質在蛋白酶體中降解[9]?；蚯贸鼺bxw8小鼠表現為胎盤異常及生長受限，提示其與生長相關[6，10]。研究表明，靶向抑制絨毛膜癌JEG-3細胞Fbxw8表達可顯著抑制細胞的增殖能力，MiR-218也可通過靶向調控Fbxw8的表達進而調節絨毛膜癌細胞的生長[11]。本實驗選擇結腸癌細胞SW480，應用siRNA干擾技術下調Fbxw8表達，利用CCK-8法、BrdU摻入法及細胞克隆形成能力試驗表明靶向抑制Fbxw8的表達可抑制SW480細胞的增殖。研究表明，p27是與腫瘤細胞增殖密切相關的蛋白，作為細胞周期依賴性激酶的抑制蛋白（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDIs），可與細胞周期蛋白/細胞周期蛋白激酶（CDK）復合體結合，從而抑制復合體活性，進而抑制細胞增殖[12，13]。在許多腫瘤細胞中，發現p27的表達下調，且此種改變與腫瘤細胞的惡性增殖密切相關[14，15]。為了明確靶向抑制Fbxw8下調結直腸癌細胞的機制，我們在Fbxw8表達下調的SW480細胞中檢測p27的表達，結果顯示p27的表達明顯升高。研究表明，p27蛋白是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。E3連接酶Skp2可識別并泛素化降解p27[16]。本研究顯示，在結直腸癌細胞SW480細胞中，下調Fbxw8表達可增加p27蛋白的表達，那么作為E3連接酶，Fbxw8下調p27是否為蛋白酶體依賴，還需進一步的實驗研究。

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Effect of siRNA targeted against Fbxw8 on cell proliferation of colon cancer cells

FENG Jinfa DAIMeng ZHANG Hao LIANG Jinlong YANG Yong YANG Zeli SUN Kan
Department of General Surgery,Heilongjiang Hospital,Haerbin 150000,China

ObjectiveTo study the effect of siRNA targeted against Fbxw8 on cell proliferation of colon cancer SW480 cells.M ethodssiRNAs targeting Fbxw8 were transfected into SW 480 cells by lipofectaminemethod.The expression of Fbxw8mRNA and protein were detected by real-time PCR and western blotting respectively.Changes in cell proliferation and DNA synthesisweremeasured by CCK-8 and clone formation assay，bromodeoxyuridine（BrdU）incorporation. In addition，changes in expression of proliferation associated genes were studied by western blotting.ResultsTwo Fbxw8 siRNAs decreased the expression of Fbxw8 mRNA and protein level，compared with the control group(0.78± 0.11),knockdown of Fbxw8 caused inhibation of cell proliferation（0.46±0.07，0.49±0.03，P＜0.05）.Fbxw8 knockdown cells generated less numbers of colonies and formed significantly smaller colonies than the control group.BrdU test showed that compared the control group(0.83±0.12),Fbxw8 siRNAs downregulated the DNA synthesis（0.47±0.06，0.56±0.09，P＜0.05）.Westren blotting showed that cyclin E was down-regulating and p27 was up-regulating.ConclusionKnockdown of Fbxw8 can reduce proliferation of SW 480 cells through down-regulation of cyclin E and up-regulation of p27 protein，Fbxw8 hasa potential value in gene therapy of colon cancer.

Colon cancer；SW480；Fbxw8；Cell proliferation；Cyclin E；p27

R735.3+5

A

1673-9701（2015）36-0025-04

2015-11-13）

黑龍江省留學歸國科學基金（LC2012C30）；黑龍江省衛生廳科研課題（2012-374）

▲通訊作者