綠絨蒿SSR-PCR反應體系的建立與優化

熊健　屈燕　冷秋思　趙琬玥

摘要：為建立適合綠絨蒿屬（Meconopsis Vig.）的SSR反應體系，以多刺綠絨蒿（M. horridula）為試材，應用L25（56）進行正交試驗，對影響SSR-PCR的主要因素進行優化。結果發現，Mg2+對PCR反應效果影響最大，而dNTPs的影響最小。5個因素水平的變化對綠絨蒿屬SSR-PCR反應體系的影響從大到小依次為Mg2+>Taq酶含量>引物濃度>DNA模板量>dNTPs濃度。適宜綠絨蒿屬的SSR反應體系：總體積25 μL，Mg2+濃度2 mmol/L，dNTPs濃度 0.2 mmol/L，引物濃度 0.5 μmol/L，DNA模板量60 ng，Taq聚合酶量 1.6 U，其余用ddH2O補充。擴增程序為94 ℃ 1.5 min;94 ℃ 20 s，最適退火溫度20 s，72 ℃ 1 min，共35個循環;72 ℃ ?5 min;4 ℃ 保存。利用優化后的反應體系對同屬另外8種綠絨蒿（M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba）進行PCR擴增，均獲得優良的擴增產物。因此，該試驗建立的反應體系適用于綠絨蒿屬植物的 SSR-PCR 反應。

關鍵詞：綠絨蒿;SSR;PCR體系優化

中圖分類號： Q949.95文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0060-04

綠絨蒿是罌粟科（Papaveraceae）綠絨蒿屬（Meconopsis）植物的總稱，有“高山牡丹”之稱。綠絨蒿是一年或多年生草本，花大而美麗，顏色豐富，有藍色、紫色、紅色、黃色，稀白色。全世界共有49種，1種產自西歐，其余48種均分布于東亞的喜馬拉雅地區，但最原始種恰在華中[1]。我國有38種，集中分布于西南部。綠絨蒿不僅花色艷麗，具有很高的觀賞價值，是著名的觀賞植物，同時還是傳統藏醫藥用植物，有清熱解毒、利尿、消炎、止痛等功效[2]。作為潛力巨大的藥用觀賞植物，目前綠絨蒿屬大多數物種已處于瀕危狀態。

簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）又稱微衛星DNA，是以1～6個堿基為基本單元的串聯重復序列。SSR分子標記具有多態性豐富、高信息量、共顯性、檢測方便等優點。SSR分子標記是目前最為常用的微衛星標記之一[3]。目前，在國內尚未有關于綠絨蒿屬植物SSR-PCR反應體系的研究成果。本研究以多刺綠絨蒿為試材，通過正交設計試驗對SSR-PCR反應體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量等5個主要因素進行探索優化，篩選出各因素的最適量，建立和優化綠絨蒿 SSR-PCR 的反應體系，為綠絨蒿屬的遺傳多樣性研究提供技術支持和參考[4]。

1材料與方法

所有試驗均于2017年12月20日至25日在西南林業大學園林學院實驗室完成。

1.1材料

試驗以多刺綠絨蒿（M. horridula）為試材及SSR引物P23進行反應體系的正交設計試驗，建立和優化反應體系，并選取M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba等8種綠絨蒿DNA以及SSR引物P2、P10、P29進行反應體系的驗證。試驗中所用到的SSR引物由筆者所在課題組通過轉錄組數據開發，并由昆明碩擎生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

1.2生物試劑

SSR-PCR反應體系中的10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTPs、Taq聚合酶、DNA maker、Loading Buffer購自綠誠生物技術有限公司。

1.3基因組DNA的提取與檢測

利用試劑盒法提取9種樣品（表2）試驗所需綠絨蒿DNA，通過微量分光光度計測定DNA的純度和純度，篩選出D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間的優質DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質量進行檢測，選出各樣品中質量最佳的[JP3]DNA各1份，稀釋至20 ng/μL，置于-70 ℃保存備用（圖1）。

1.4SSR-PCR反應體系的正交試驗設計

以M. horridula為試材，利用引物P23進行正交試驗。優化SSR-PCR的正交試驗以L25（56）正交表進行設計，以5因素（Mg2+、dNTPs、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量）的5個水平進行正交試驗，共25個組合（表3）。PCR擴增體系為 25 μL體系，除了添加表3內的各種反應液外，需添加ddH2O進行補充。試驗進行2次重復。

1.5PCR擴增與檢測

PCR反應在BIOMETRA TProfessional standard梯度PCR儀上進行。反應體系為25 μL體系。反應組合共25個，在退火溫度設置為60 ℃下進行1次PCR擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR反應程序見表4。

擴增產物取2 μL加入4 μL Loading Buffer，通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠通過BioSpectvum AC Chemi HR 410凝膠成像儀進行成像觀察并保存膠圖。

1.6統計與數據分析

參照何正文等的方法[5]，根據擴增條帶的清晰度、彌散程度以及特異性對每個條帶進行獨立評分，最高記10分（條帶清晰，彌散程度弱，特異性高），最低記1分。利用SPSS 17.0軟件對2次重復試驗的評分值總數進行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反應體系的驗證