環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在病原生物檢測(cè)中的應(yīng)用

黃枝妙(綜述)，翁育偉(審校)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在病原生物檢測(cè)中的應(yīng)用

黃枝妙(綜述)，翁育偉(審校)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡便、快速、特異性高、靈敏性高等特點(diǎn)，自2000年開發(fā)以來，在短短的十幾年內(nèi)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原生物的檢測(cè)，在即時(shí)檢驗(yàn)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣中有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；病原生物；檢測(cè)

病原生物的檢測(cè)有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)等。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法耗時(shí)長而且易出現(xiàn)污染和漏檢現(xiàn)象；血清學(xué)檢測(cè)方法會(huì)出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)，造成判斷困難，且在疾病較早期易出現(xiàn)假陰性；相比之下，以病原體核酸靶序列擴(kuò)增為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法不但所需時(shí)間短而且敏感性、特異性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)和新發(fā)傳染病檢測(cè)等領(lǐng)域。核酸擴(kuò)增技術(shù)主要分為以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)的變溫?cái)U(kuò)增以及等溫?cái)U(kuò)增兩大類。其中變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要經(jīng)過變性、退火、延伸等步驟多次循環(huán)，在此過程中反復(fù)升溫降溫，不但對(duì)儀器要求比較高，而且反應(yīng)耗時(shí)較長，不利于節(jié)省時(shí)間成本。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)所需溫度恒定，利用水浴或金屬浴就可以實(shí)現(xiàn)，所需時(shí)間短。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括很多種：依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[1]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)[2]、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification，SDA)[3]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification，LAMP)[4]等。其中，近些年來使用比較廣泛、發(fā)展比較快的是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，該技術(shù)操作簡便、快速、特異性高、靈敏性高，在短短十幾年內(nèi)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原生物的檢測(cè)，在即時(shí)檢驗(yàn)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣中有重要意義。

1 LAMP技術(shù)介紹

1.1 LAMP技術(shù)原理 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由日本的Notomi等[4]于2000年開發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)使用了一種特殊的鏈置換型DNA聚合酶(Bst-DNA polymerase)，該酶能夠在恒溫(60～65℃)條件下以雙鏈DNA中的一條鏈為模板合成新鏈，并將另外一條鏈替換掉。LAMP技術(shù)針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)兩條內(nèi)引物和兩條外引物，可在15min～60min內(nèi)對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增，如果同時(shí)采用兩條環(huán)狀引物，還可以促進(jìn)目的片段的擴(kuò)增，大大提高反應(yīng)速度[5]。LAMP技術(shù)針對(duì)6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)的4條特殊引物，分別為上游外引物F3、上游內(nèi)引物FIP、下游外引物B3和下游內(nèi)引物BIP，其中，內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2，兩者可以直接相連或者以TTTT連接；內(nèi)引物BIP包含B1c和B2，兩者可以直接相連或者以TTTT連接。

LAMP擴(kuò)增過程主要分為兩個(gè)階段：起始階段和擴(kuò)增循環(huán)階段。

起始階段：在LAMP擴(kuò)增體系中，由于內(nèi)引物的Tm值和濃度都大于外引物，所以內(nèi)引物會(huì)先于外引物結(jié)合到模板上并延伸產(chǎn)生子鏈，之后外引物結(jié)合到模板，并通過子鏈的延伸將內(nèi)引物鏈置換下來。經(jīng)過FIP (F1c+F2)、F3、BIP (B1c+B2)、B3四個(gè)引物先后作用，最終被置換出的互補(bǔ)鏈結(jié)構(gòu)為3′-F1-F2c-F1c……B1-B2-B1c-5′，其中F1和F1c互補(bǔ)，B1c和B1互補(bǔ)，形成兩端環(huán)狀的啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)(見圖1)。

圖1 起始階段Fig.1 Starting material producing step

擴(kuò)增循環(huán)階段：在這一階段中外引物不再起作用，內(nèi)引物繼續(xù)引導(dǎo)鏈置換延伸。啞鈴狀結(jié)構(gòu)以3′末端的F1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)IP(F1c+F2)中的F2區(qū)與莖環(huán)處的F2c區(qū)結(jié)合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，迅速以3′末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換，結(jié)果形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，然后BIP(B1c+B2)引物上的B2區(qū)與其雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。每進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物DNA長度增加一倍，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物(見圖2)。

1.2 LAMP引物設(shè)計(jì)原則 LAMP是通過兩對(duì)引物對(duì)6個(gè)不同區(qū)域的識(shí)別進(jìn)行擴(kuò)增的，因此對(duì)引物設(shè)計(jì)要求比較高。影響LAMP引物設(shè)計(jì)的因素主要有Tm值、引物末端穩(wěn)定性、GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間距。(1)Tm值采用Nearest-Neighbor算法，F(xiàn)1c和B1c的Tm值約65℃(64 ℃～66 ℃)，F(xiàn)2、B2、F3和B3的Tm值約60 ℃(59 ℃～61 ℃)，環(huán)引物的Tm值約65℃(64 ℃～66 ℃)；(2)引物末端做為DNA合成的起始位點(diǎn)，需要有一定的穩(wěn)定性，F(xiàn)2/B2，F(xiàn)3/B3和LF/LB的3′端以及F1c/B1c的5′端的自由能要≤-4 kcal/mol；(3)引物的GC含量要控制在40%～65%之間，以50%～60%為最佳；(4)設(shè)計(jì)引物時(shí)要避免二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，為了防止引物二聚體形成還要確保3′端不與其他序列互補(bǔ)并極力避免AT富集；(5)LAMP的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镕2～B2區(qū)段，最好在130 bp～200 bp之間，過長或過短都會(huì)影響擴(kuò)增效率，最長300 bp，不可超過500 bp，否則會(huì)嚴(yán)重影響擴(kuò)增效率。最理想的引物間距是：F2的5′端和B2的5′端相距120～160 bp，F(xiàn)2的5′端與F1c的3′端(B2的5′端與B1c的3′端)相距40～60 bp，F(xiàn)3的3′端和F2的5′端(B3的3′端和B2的5′端)相距0～60 bp。

目前，已經(jīng)有針對(duì)LAMP引物設(shè)計(jì)的在線軟件出現(xiàn)。試驗(yàn)者只要根據(jù)需要選擇合適的目的基因，在NCBI等數(shù)據(jù)庫中檢索出目的基因核苷酸序列，提交到Primer-Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)相應(yīng)的LAMP引物，然后通過Primer 5.0或oligo 7等軟件進(jìn)行分析，確保引物之間無二聚體形成，最后再通過BLAST檢驗(yàn)引物的特異性。

1.3 LAMP反應(yīng)體系 LAMP反應(yīng)體系：兩對(duì)內(nèi)外引物、dNTP、甜菜堿、Tris-HCl(pH 8.8)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton X-100、模板、Bst-DNA聚合酶。體系中會(huì)對(duì)LAMP反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響的幾個(gè)比較重要的因素有：(1)Bst-DNA聚合酶：具有鏈置換活性，在延伸新鏈的同時(shí)可以將下游舊鏈剝離。(2)內(nèi)外引物濃度比例：內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP擴(kuò)增體系影響重大，因此，除了引物Tm差異外，內(nèi)引物的濃度要大于外引物濃度，這樣才能先于外引物結(jié)合到模板上。一般情況下外引物和內(nèi)引物的濃度比在1/4～1/10之間。(3)甜菜堿濃度：甜菜堿可以使雙鏈DNA處于解鏈的動(dòng)態(tài)平衡中，從而提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率。(4)鎂離子濃度：鎂離子濃度太低會(huì)降低聚合酶活性，影響反應(yīng)的進(jìn)行，濃度太高又會(huì)降低反應(yīng)的特異性。因此，反應(yīng)必須對(duì)鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化。(5)dNTP濃度：dNTP是核酸合成的底物，濃度低，底物不足，影響反應(yīng)進(jìn)行，濃度過高，過量的dNTP會(huì)與鎂離子螯合，影響酶活性。

圖2 擴(kuò)增循環(huán)階段Fig.2 Amplification and cycling step

1.4 LAMP產(chǎn)物鑒定方法

1.4.1 白色沉淀 DNA復(fù)制過程中，當(dāng)一個(gè)dNTP結(jié)合到DNA鏈上的同時(shí)會(huì)解離下一個(gè)焦磷酸根離子，該離子與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合可產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀。由于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過程中，DNA進(jìn)行大量復(fù)制，所產(chǎn)生的焦磷酸根離子與鎂離子結(jié)合可產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，因而在反應(yīng)的末期通過肉眼就可以觀察到白色沉淀。但是通過肉眼觀察主觀性和不確定性較大，且陽性樣品的渾濁度維持的時(shí)間相對(duì)短暫，因而宜在反應(yīng)結(jié)束后盡快進(jìn)行觀察。此外，可以通過濁度儀，實(shí)時(shí)檢測(cè)管內(nèi)的濁度變化。但由于焦磷酸鎂沉淀顆粒大小不均一，空間分布不均勻，樣品達(dá)到最高渾濁度前焦磷酸鎂顆粒可能重新溶解，這些因素同樣會(huì)影響實(shí)時(shí)濁度儀的檢測(cè)結(jié)果[6]。

1.4.2 金屬離子指示劑 LAMP反應(yīng)過程中會(huì)解離出焦磷酸根離子，焦磷酸根離子又會(huì)與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合產(chǎn)生白色沉淀。因此，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子或焦磷酸根離子濃度的變化可以間接判斷產(chǎn)物的擴(kuò)增情況，這種間接染色法比較常用的是鈣黃綠素和羥基萘酚藍(lán)離子指示劑[7]。(1)鈣黃綠素：這種檢測(cè)方法是在反應(yīng)液中加入鈣黃綠素和錳離子，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行前鈣黃綠素與錳離子結(jié)合處于淬滅狀態(tài)，溶液為橙色，而在擴(kuò)增反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸離子可與錳離子結(jié)合，導(dǎo)致鈣黃綠素釋放，淬滅狀態(tài)解除發(fā)出黃綠色熒光。(2)羥基萘酚藍(lán)：反應(yīng)前將羥基萘酚藍(lán)加入到反應(yīng)液中，溶液呈紫羅蘭色，反應(yīng)過程中鎂離子與反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸根離子結(jié)合產(chǎn)生大量沉淀，鎂離子濃度降低，pH發(fā)生變化，從而使羥基萘酚藍(lán)的顏色變?yōu)樘焖{(lán)色。金屬離子指示劑檢測(cè)的靈敏度比白色沉淀法高，但同樣要通過肉眼觀察判斷，同樣會(huì)存在一些主觀誤差，而且由于指示劑在反應(yīng)前加入，會(huì)在一定程度上對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

1.4.3 DNA嵌入染料 DNA嵌入染料具有特定的分子結(jié)構(gòu)，可以選擇性的結(jié)合到雙鏈DNA分子上，常見的DNA嵌入染料有SYBR Green I和溴化乙錠等。1)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)：游離的SYBRGreen I發(fā)出微弱的綠色熒光，但與DNA雙鏈結(jié)合后熒光會(huì)大大增強(qiáng)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)。反應(yīng)前在體系中加入SYBRGreen I，通過實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀可以檢測(cè)出體系中雙鏈DNA的擴(kuò)增情況。這種方法可以實(shí)時(shí)快速地檢測(cè)反應(yīng)情況，但SYBRGreen I會(huì)抑制LAMP反應(yīng)。2)凝膠電泳檢測(cè)：溴化乙錠也是一種常用的核酸熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。LAMP產(chǎn)物與溴化乙錠結(jié)合進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，會(huì)出現(xiàn)特異性梯形條帶，由于可以對(duì)條帶大小進(jìn)行判定，所以這種方法的特異性較高，但會(huì)加大工作量且容易造成污染。

1.4.4 隨著LAMP技術(shù)的快速發(fā)展，除了以上幾種比較常見的鑒定方法外，還出現(xiàn)了很多新的鑒定方法：橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(LAMP-LFD)[8]、酶聯(lián)免疫吸附(LAMP-ELISA)[9]、電化學(xué)方法、NanoAu探針、場(chǎng)效應(yīng)傳感器、表面等離子共振傳感器、擴(kuò)增子吸光度、生物熒光、巨磁阻傳感器等。

1.5 LAMP技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

1)高效性：由于LAMP在等溫條件下進(jìn)行，無需像常規(guī)PCR反應(yīng)那樣反復(fù)升降溫造成時(shí)間損失，一般在1h內(nèi)即可完成擴(kuò)增，使靶序列達(dá)到109個(gè)拷貝[4]。如果使用環(huán)引物還可以縮短一半的擴(kuò)增時(shí)間。這對(duì)臨床，尤其是應(yīng)急檢測(cè)具有重要的意義。2)高靈敏度：LAMP反應(yīng)對(duì)模板的要求不高，幾乎不受反應(yīng)液中存在的大量外源DNA和其它雜質(zhì)的影響，對(duì)模板DNA無需純化，甚至只要將樣品超聲裂解即可用來檢驗(yàn)，檢出率比普通PCR高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。3)高特異性：針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，6個(gè)區(qū)域中任一區(qū)域不匹配都無法進(jìn)行擴(kuò)增，這就決定了擴(kuò)增的高特異性。4)成本低廉：LAMP反應(yīng)溫度恒定，只需要水浴鍋或金屬浴就可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)條件，所需儀器成本低，便于在基層單位進(jìn)行推廣。5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可視化：可直接用肉眼觀察擴(kuò)增管的濁度，或者添加熒光染料通過顏色變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。6)通過與反轉(zhuǎn)錄技術(shù)結(jié)合，LAMP技術(shù)也可以高效擴(kuò)增RNA序列。RT-LAMP方法可以先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，也可以直接在LAMP反應(yīng)液中直接加入逆轉(zhuǎn)錄酶。7)缺點(diǎn)：擴(kuò)增靈敏度高，效率高，易受到污染產(chǎn)生假陽性，應(yīng)盡量避免或減少開蓋；對(duì)引物要求高，有些基因序列比較難設(shè)計(jì)出合適的引物；擴(kuò)增片段一般不超過300 bp，不能進(jìn)行長片段DNA擴(kuò)增。

2 LAMP技術(shù)在病原生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌檢測(cè) 甲類傳染病鼠疫和霍亂都是由細(xì)菌引起的，近些年來隨著衛(wèi)生條件的改善，這兩種疾病在人類中已經(jīng)比較罕見，但在世界范圍內(nèi)的自然疫源地并未縮小，對(duì)于衛(wèi)生條件較差的貧困地區(qū)，仍然存在暴發(fā)的可能性，所以仍需對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，不能掉以輕心。除此之外，在空氣、水源和食物等與人類息息相關(guān)的事物中同樣存在著一些其它致病細(xì)菌，細(xì)菌性疾病仍然對(duì)人體的健康造成很大的威脅。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)是細(xì)菌檢測(cè)最常用的方法之一，然而細(xì)菌培養(yǎng)方法不僅繁瑣，而且耗時(shí)長，例如，嚴(yán)重危害人類健康的結(jié)核分枝桿菌，生長緩慢，一般2～4周才可見菌落生長，影響疾病的確診。LAMP技術(shù)不但操作方便，易于在自然疫源地開展檢測(cè)活動(dòng)，而且反應(yīng)速度快，在臨床診斷上有重要的意義，在30～35 min內(nèi)即可完成對(duì)肺結(jié)核的檢測(cè)[10]。目前LAMP技術(shù)已經(jīng)被用于多種致病菌的檢測(cè)當(dāng)中，例如，霍亂弧菌[11]、沙門氏菌[12]和金黃色葡萄球菌[13]等，除此之外，結(jié)核桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌和艱難梭菌等已經(jīng)有了商品化的LAMP恒溫快速檢測(cè)試劑盒。

2.2 病毒檢測(cè) 病毒的變異速度相對(duì)比較快，特別是RNA病毒，近些年來出現(xiàn)很多新發(fā)傳染病，基本上都是病毒性疾病。為了有效防止病毒性疾病的傳播感染，需要建立一種能夠?qū)Σ《具M(jìn)行快速檢測(cè)的方法。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法和血清學(xué)鑒定耗時(shí)較長，所以一般先采用分子生物學(xué)核酸檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，而相比于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，LAMP技術(shù)所需時(shí)間更短，能夠更加快速地檢測(cè)出病毒核酸。在LAMP技術(shù)出現(xiàn)的這十幾年來，很多研究者已經(jīng)將其廣泛應(yīng)用于各種病毒性疾病的檢測(cè)當(dāng)中。

2007年，Kurosaki等[14]建立了快速檢測(cè)扎伊爾埃博拉病毒的RT-LAMP方法，該方法可以在26 min內(nèi)檢測(cè)到20個(gè)拷貝的人工合成的扎伊爾埃博拉病毒RNA，或者10-3FFU的傳代細(xì)胞培養(yǎng)病毒。2013年，Yiyue Ge等[15]對(duì)HA基因和NA基因進(jìn)行擴(kuò)增，建立了檢測(cè)H7N9病毒的RT-LAMP-LFD方法，通過對(duì)80份H7N9疑似病例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比均達(dá)到了100%。2014年，Shirato等[16]建立了檢測(cè)MERS-CoV的RT-LAMP方法，能夠檢測(cè)出低至3～4個(gè)拷貝的RNA，具有高度的特異性，且不會(huì)與其它呼吸道病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。2012年，Kai Nie等[17]利用直接熱處理原始樣品進(jìn)行RT-LAMP的方法檢測(cè)出咽拭子中的EV71病毒C4亞型，其敏感性和特異性與提取完RNA再進(jìn)行RT-LAMP的方法相比分別為90.3%和100%，與qRT-PCR相比為86.83%和100%。除此之外，國內(nèi)外許多研究者也成功地使用LAMP技術(shù)檢測(cè)出諾如病毒[18]、新布尼亞病毒[19]、登革熱病毒[20]和人乳頭瘤病毒[21]等，LAMP技術(shù)在病毒性疾病的檢測(cè)中有廣闊的前景。

2.3 寄生蟲檢測(cè) 在一些偏遠(yuǎn)地區(qū)或者是野外，衛(wèi)生環(huán)境比較差，容易引發(fā)寄生蟲病的感染。而LAMP技術(shù)操作方便，可省去DNA抽提環(huán)節(jié)，用肉眼觀察渾濁度可做出定性判斷，為寄生蟲病的現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查提供了方便。目前，LAMP技術(shù)在寄生蟲包括原蟲、蠕蟲乃至其宿主的檢測(cè)中得到了應(yīng)用。瘧疾是全球三大公共衛(wèi)生問題之一，2014年，江再茂等[22]針對(duì)惡性瘧原蟲核糖體DNA的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)LAMP引物，成功地檢測(cè)出了血液中的惡性瘧原蟲，克服了傳統(tǒng)血膜染色法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且容易漏診、誤診的缺點(diǎn)。2014年，陳璐等[23]針對(duì)棘球絳蟲ND2基因設(shè)計(jì)引物，建立LAMP檢測(cè)方法，鑒別出多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲這兩個(gè)相近的種屬，且不與其它待檢寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)限度為40拷貝。此外，對(duì)剛地弓形蟲[24]、利什曼原蟲病[25]、布魯格絲蟲病[26]、泰國肝吸蟲[27]等進(jìn)行LAMP檢測(cè)的方法也已經(jīng)建立起來，并得到不斷深入的研究。

2.4 與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用 由于LAMP技術(shù)反應(yīng)條件溫和，敏感性強(qiáng)，特異性高，反應(yīng)速度快等特點(diǎn)，人們將其與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，開發(fā)了一些很有意義的檢測(cè)病原生物的方法。Jung等[28]將多重RT-LAMP和免疫層析試紙條相結(jié)合(RT-LAMP-ICS)，檢測(cè)出臨床樣品中僅10個(gè)拷貝的甲型流感病毒，并得出其分型(H1N1、H3N2、H5N1)。Aaruyama等[29]將LAMP和原位雜交相結(jié)合，建立了In-Situ-LAMP技術(shù)，用于檢測(cè)組織細(xì)胞中大腸桿菌O157∶H7。Seetang-Nun等[30]將納米金顆粒標(biāo)記的DNA探針與LMAP技術(shù)相結(jié)合，建立了用肉眼觀察白斑綜合征病毒的方法。

3 展 望

LAMP技術(shù)靈敏度高，可以檢測(cè)到單個(gè)拷貝的核酸，對(duì)DNA要求不高，樣品甚至只需經(jīng)過超聲裂解即可做為擴(kuò)增模板，再加上其反應(yīng)溫度恒定，在1h內(nèi)即可擴(kuò)增109個(gè)拷貝，所以在臨床檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有重大的意義。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)所需溫度恒定，不需要使用昂貴儀器，一旦建立了一種病原生物的LAMP檢測(cè)方法，就可以在基層單位和現(xiàn)場(chǎng)中推廣，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Loop mediated isothermal amplification and its application in pathogenic organisms detection

HUANG Zhi-miao,WENG Yu-wei

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

Loop mediated isothermal amplification (LAMP) technology is a novel nucleic acid amplification technology developed in recent years. Because of its simplicity, rapidity, high specificity and high sensitivity, it has been widely used in the detection of pathogenic organisms such as bacteria, viruses and parasites in the past dozen years since 2000, it has important significance of point-of-care test and local laboratory promotion.

Loop mediated isothermal amplification；pathogenic organisms;detection

福建省疾病預(yù)防控制中心,福州 350001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.019

R781

A

1002-2694(2015)11-1075-06

2015-05-23；

2015-07-21