新型苯并噻唑衍生物YLT322誘導結直腸癌細胞的凋亡作用及機制研究

易曉紅，宋雪皎，賀玉萍，高添桃，雷倩，余洛汀

·藥理毒理·

新型苯并噻唑衍生物YLT322誘導結直腸癌細胞的凋亡作用及機制研究

易曉紅1,2，宋雪皎1，賀玉萍2，高添桃1，雷倩1，余洛汀1

目的：YLT-322是本實驗室合成的一種新型的苯并噻唑衍生物,已有文獻證實其可以通過線粒體途徑誘導肝癌細胞HepG2凋亡,對多種癌細胞都有效果。本實驗擬通過一系列生物實驗來考察YLT-322對結直腸癌細胞的作用。方法：作者對多種癌細胞進行初篩,篩選出兩種效果較好的結直腸癌細胞進行細胞毒性試驗,平板克隆形成,Hoechst等實驗,以證實YLT-322對結直腸癌有良好的抑制作用。結果：YLT-322實驗組比對照組的細胞凋亡明顯增多，且與劑量和作用時間成正比。說明YLT-322的確對結直腸癌有抑制作用。結論：YLT-322對結直腸癌細胞有誘導凋亡的作用，作為一個新型的小分子抑癌藥物,具有很大的開發價值。

苯并噻唑衍生物；YL-T322；結直腸癌；凋亡；細胞毒性試驗；平板克隆；Hoechst

目前,據世界衛生組織統計,結直腸癌已成為世界男性第三位、女性第二位高發的惡性腫瘤。近年來，中國的結直腸癌發病率呈上升趨勢，增長速度迅猛，中國已經是絕對數和相對數都高發的結直腸癌大國。目前臨床上用于治療晚期癌癥的化療藥物常為傳統的細胞毒類化療藥物，總體上效果不佳，且毒副作用較大。因此，發現新型抗腫瘤藥物迫在眉睫。苯并噻吩及其衍生物是一類重要的有機合成中間體，尤其是衍生物具有多種生物活性，在醫藥領域有很重要的作用。近年來，其抑癌作用得到越來越多的關注。YLT322是本實驗室合成的一種新型的苯并噻唑衍生物，已有實驗證實，其可以通過線粒體途徑誘導癌細胞凋亡，對多種癌細胞都有效果。本研究選定兩種結直腸癌細胞進行一系列藥理實驗，結果證明YLT-322能夠促進結直腸癌細胞凋亡，具有很好的開發前景。

1 材料

1.1 儀器

純水儀（ EASYpure UF 07412,Millipore公司）；高效液相色譜儀（HPLC） （Waters Alliance HPLC,Waters公司）；全自動洗片機 （MXP 102, Kodak公司）；層流超凈工作站（ NUAIR，SANYO公司）；二氧化碳細胞培養箱 （3111，Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡 （IX50,Olympus

公司）；普通光學顯微鏡 （CHS, Olympus公司）；高速離心機（ Centrifuge 5415C, Eppendorf公司）；低速離心機 （Megafuge 1.0, Heraeus公司）；-80℃冰箱 （SANYO公司）；恒溫培養箱（ CO2Incubator, SANYO公司）；高壓滅菌鍋（LaboAutoclave,SANYO公司）；pH計（ pH meter 345 Coring公司）；流式細胞儀（ ESP Elite, Beckman Coulter公司）；蛋白質電泳及電轉移裝置（ Mini PROTEAN 2&3 Cell, BIO-RAD公司）；臺式酶標儀（ SpectraMax M5, Molecular Devices公司）；96孔細胞培養板（ Costa，Corning公司）；移液器（Thermo公司）。

1.2 藥品及主要試劑

YLT322（本實驗室自主合成），YLT-322是由本實驗室（生物治療國家重點實驗室）自主合成的一種苯并噻唑衍生物，其結構式見圖1。

圖1 YLT-322結構式

RPMI-1640 （美國Gibico BRL公司）；DMEM（美國Gibico BRL公司）；四甲基偶氮唑藍(MTT)（美國Sigma公司）；二甲基亞砜(DMSO) （美國Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibico BRL公司）；Hoechst33342（碧云天公司）；胎牛血清（FBS） （美國Gibico BRL公司）；結晶紫染料（國Sigma公司）。

1.3 細胞株

1.3.1 人結直腸癌細胞株SW620：來自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本實驗室保存。

1.3.2 人結直腸癌細胞株SW480：來自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本實驗室保存。

2 方法與結果

2.1 MTT法細胞毒性實驗

SW620,SW48兩種細胞鋪96孔板，10000/孔，5000/孔，3000/孔各一板。用YLT322(已用二甲基亞砜(DMSO)配成10 mmol．L-1的初始濃度)處理，DMEM培養基對半稀釋，最后配成濃度分別為10、 5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol．L-1，作用時間為24 h，48 h，72 h，留1組不加藥作為對照。加入10 μL MTT（5 mg．mL-1），37度孵育2 h，加入150 μLDMSO約15分鐘，待甲瓚全部溶解，酶標儀檢測吸光度，計算抑制率。結果見圖2和圖3。

圖2 SW620細胞毒性試驗

圖3 SW480細胞毒性試驗

圖2和圖3可以看出，在加藥后24 h和48 h，隨著濃度的增加,YLT-322對細胞有明顯的抑制增殖作用,但加藥后72小時，隨著YLT-322濃度和作用時間的增加，細胞的抑制率較低，由此可知YLT-322對SW620和SW480有濃度依賴性和時間依賴性，說明YLT-322對SW620和SW480有促進凋亡的作用，且在48h左右作用效果最好。另外，低濃度偶可會出現抑制率為負值的情況，原因可能是藥物本身的特點，和作用時間有關，或者是邊緣效應。

2.2 平板克隆形成

SW620, SW480細胞鋪6孔板，每孔300個，第2天用YLT-322處理，濃度依次為4、2、1、0.5、0.25 μmol．L-1，留1孔不加藥作為對照。處理時間為14天左右，中間4天更換一次培養基。用PBS洗兩次，多聚甲醛固定十分鐘，結晶紫染色。結果見圖4和圖5。

圖4 SW480平板克隆形成實驗

圖5 SW620平板克隆形成實驗

從圖4和圖5可看出，隨著YLT-322濃度的降低，細胞克隆數量越來越多，說明藥物對細胞有良好的抑制增殖的作用。

2.3 Hoechst

SW620, SW480細胞6孔板做細胞爬片，每孔1.0×105個，第二天用YLT-322處理，濃度依次為4、 2 、1 μmol．L-1（細胞毒性實驗中， 0.5和0.25 μmol．L-1對細胞抑制率極低，沒必要再做實驗）,留1孔不加藥作為對照。處理48小時，hoechst 33342染色，取出爬片 ，熒光倒置顯微鏡觀察。結果見圖6和圖7。

圖6 SW620Hoechst觀察

圖7 SW480Hoechst觀察

Hoechst是一種DNA染料，可使細胞核著色，是測凋亡的經典方法。正常細胞的細胞核染色均勻，熒光強度低，凋亡細胞的細胞核固縮、碎裂，細胞膜內陷，熒光強度較高。圖6和圖7可看出高濃度的組細胞核有碎裂，亮度較高，出現凋亡小體，證明YLT-322可促進此兩種癌細胞凋亡。

3 討論

YLT-322是本實驗室自主合成的抗癌新藥，已有前期實驗證明其對肝癌有很好的活性，并且已申請專利。本實驗進一步證明此化合物對結直腸癌細胞作用也很好，但由于時間所限，并未進行動物實驗，相信在不久的將來，YLT-322將成為抗癌家族的重要一員，發揮其應有的作用，為癌癥治療帶來新希望。

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（責任編輯：陳思敏）

Effect and mechanism of a novel Benzothiazole derivative YLT322 induce apoptosis in colorectal cancer cell

/YI Xiaohong1,2, SONG Xue-jiao1, HE Yu-ping1, GAO Tian-tao1, LEI Qian1, YU Luo-ting1// (1. State Key Laboratory of Biological Treatment of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan; 2. Basic Medical College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:YLT-322 was a new benzothiazole derivatives synthesized in our laboratory. There were literature reported that it could induce apoptosis in HepG2 via mitochondrial pathway. And it had effects on a variety of cancer cells. This experiment meant to investigate the effect of YLT-322 on colorectal cancer cells by a series of biological experiments.Method:Many kinds of cancer cells were screened. Two colorectal cancer cells were selected to carry out toxicity test, plate clone formation, Hoechst experiment to confirm that YLT322 had good inhibition effect on colorectal cancer.Result:Experimental group treated with YLT-322 signifcantly increased apoptotic cells compared with control group. And the effect of YLT-322 was proportional to the dose and duration time which confrmed the inhibition of YLT-322 on colorectal cancer.Conclusion:YLT-322 induce apoptosis in colorectal cancer cells. It has great value of development as a novel small molecule anti cancer drug.

Benzothiazole derivative YLT322; colorectal cancer; apoptosis; cell toxicity test; plate clone formation; Hoechst

R 73-3

A

1674-926X(2015)02-020-03

1.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041;2.成都中醫藥大學基礎醫學院，四川成都 611137

易曉紅，女，32歲，成都中醫藥大學講師，在讀碩士研究生

Tel:13540667372 Email:13540667372@163.com

余洛汀，男，四川大學生物治療國家重點實驗室，博士生導師 Email:luodyu@163.com

2015-01-26