水稻根系響應鎘脅迫的蛋白質差異表達

肖清鐵, 王經源, 鄭新宇, 戎 紅, 張國君, 王良華, 謝惠玲, 李 藝, 陳 珊, 林瑞余, 林文雄

福建農林大學生命科學學院農業生態研究所, 福州 350002

水稻根系響應鎘脅迫的蛋白質差異表達

肖清鐵, 王經源, 鄭新宇, 戎 紅, 張國君, 王良華, 謝惠玲, 李 藝, 陳 珊, 林瑞余*, 林文雄

福建農林大學生命科學學院農業生態研究所, 福州 350002

為探討水稻根系對鎘脅迫的分子生理響應，以抗鎘水稻PI312777和鎘敏感水稻IR24為材料，設置Cd2+濃度為0、50和100μmol/L的水培試驗，處理7d后分析了水稻根系的蛋白質差異表達。結果表明，在鎘脅迫下水稻PI312777和IR24根系有18個蛋白質發生了差異表達，其中的12個得到MALDI-TOF/MS鑒定。這些鑒定的蛋白功能可分四類：(1)與活性氧(ROS)脅迫相關的過氧化物酶(POD)、蛋氨酸腺苷轉移酶(MAT)、類萌發素蛋白前體；(2)與谷胱甘肽(GSH)合成相關的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)；(3)與逆境脅迫相關的ABA脅迫誘導蛋白含HVA22域蛋白、ABA-脅迫-成熟誘導蛋白5(ASR5)；(4)與細胞分裂調控相關的GTP結合核蛋白Ran-2。鎘脅迫下SAMS和GTP結合核蛋白Ran-2在兩種水稻根系均發生上調表達；MAT、POD、類萌發素蛋白前體和GS發生下調表達；依賴NADP-GDH、GDH和磷酸甘油酸變位酶在IR24根部均發生下調表達，在PI312777根部僅在100μmol/L Cd2+處理發生下調表達；含HVA22域蛋白在PI312777根部上調表達，在IR24根部發生下調表達；ASR5在PI312777根部上調表達，在IR24根部的表達無顯著差異；100μmol/L Cd2+脅迫下60S酸性核糖體蛋白P0在水稻PI312777根部表達下調，在IR24根部表達上調。可見，鎘脅迫使水稻根部ROS增加，形成氧化脅迫反應，造成毒害作用，而水稻根通過調節SAMS和GS提高GSH合成降低鎘毒害。ASR5和HVA22蛋白等逆境脅迫蛋白的表達差異則是水稻品種間抗性差異的重要原因之一。

水稻;根系;鎘;脅迫反應;蛋白質組學

鎘(Cd)是生物毒性最強的土壤污染物之一，它極易在植物體內積累，并通過食物鏈影響動物與人類的健康[1]。水稻是我國最重要的糧食作物，隨著工業三廢的大量排放及化肥農藥的大量使用，稻田鎘污染日益嚴重，大米鎘污染已引起政府部門的高度關注[2]。根系是植物最先感受逆境的器官，也是植物吸收礦質營養、水分以及有害物質的主要通道。研究發現水稻吸收到體內的Cd2+大部分累積在根部，嚴重抑制根系生長，使根彎曲，根數減少[3]；直接或間接作用于DNA分子，引起DNA分子損傷[4]；影響細胞分裂、誘發染色體畸變等，且隨著鎘濃度的提高，這種傷害增強[5]。水稻根部通過改變氧化酶活性、形成GSH、PC絡合解毒、生成金屬轉運蛋白等來降低鎘的毒害作用[1]，但這些反應的過程是十分復雜的，其調控機制并不明確，尚待研究。此外，不同水稻品種的鎘抗性不同，其鎘吸收能力存在差異[6]，但這種差異形成的原因和機制尚不明確。因此，研究不同抗性品種水稻根系對鎘脅迫的響應對揭示水稻的鎘抗性與鎘在水稻體內的積累機制具有重要意義。目前對于不同品種水稻根對鎘脅迫的不同抗性研究主要集中在形態(生物量、根長及根尖細胞微觀結構)、生理(SOD、POD、CAT活性)等方面[3,7]，對根系其他方面的研究卻較少。為此，本研究擬用抗鎘水稻PI312777和鎘敏感水稻IR24為材料，應用差異蛋白質組學方法，分析兩種水稻的根系在Cd脅迫條件下的蛋白質表達變化，以期為研究水稻響應鎘脅迫的分子機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗在福建農林大學農業生態研究所網室內進行。選取抗鎘水稻品種PI312777和鎘敏感水稻品種IR24為供試材料[7]。在3葉期將水稻秧苗移栽至塑料盆(40cm×30cm×15cm)中用10L營養液(參照國際水稻研究所常規營養液配方[8])進行水培。5葉期時，在營養液中添加50μmol/L和100μmol/L Cd2+溶液進行脅迫處理(不添加為空白對照)，每個處理3次重復。處理7d后，選取生長一致的水稻秧苗，獲取根系樣品并立即置于液氮中，用于蛋白質提取[9]。

1.2 蛋白質樣品溶液制備

取4.0g水稻根，按王經源等[10]的TCA-丙酮沉淀法進行蛋白質提取。取適量蛋白質干粉加入裂解液[9mol/L尿素，1%二硫蘇糖醇(DTT)，4%CHAPS，2%Ampholine(pH 3—10)]，20—25℃水浴超聲30min，然后在25℃下18000r/min離心15min，棄沉淀，上清液即蛋白質樣品溶液，置于-80℃冰箱保存備用。蛋白質樣品濃度用Brandford方法進行定量[11]。

1.3 雙向電泳與凝膠成像

(1)等電聚焦 采用自制的18cm膠條(尿素1.854g；15%ACR 0.900g；超純水0.234g；10%NP-40為0.68g；pH 3—10的兩性電解質61μL；pH5—8的兩性電解質244μL；10%過硫酸銨7.2μL；TEMED15.0μL)進行等電聚焦，上樣量150μg，聚焦電壓參數：200V×0.5h，300V×0.5h，400V×0.5h，500V×0.5h，600V×0.5h，800V×14h，1000V×4h。

(2)SDS-PAGE電泳 膠條置于平衡緩沖液[60mmol/LTris-HCl(pH6.8)，2%SDS，5% 巰基乙醇，10%甘油，0.05%溴酚藍]平衡30min，后進行SDS-PAGE(電泳參數為: 每板10mA×10h)。

(3)硝酸銀染色 電泳結束后，SDS-PAGE膠經固定液(50%甲醇，5%冰醋酸)×30min，增敏液(30%乙醇0.2%硫代硫酸鈉，6.8%醋酸鈉)×30min，硝酸銀染色液(2.5%硝酸銀，0.4%甲醛)×20min，顯色液(2.5%碳酸鈉，0.2%甲醛)顯色，5%冰醋酸終止顯色。

(4)圖譜分析 銀染后的SDS-PAGE膠用Image Scanner Ⅲ掃描儀掃描，構建蛋白質表達圖譜。采用Image Master 5.0版軟件對圖譜進行分析，表達豐度差異達1.5倍以上的蛋白質點標記為差異點[9]。

1.4 質譜分析

從SDS-PAGE膠上挖取的差異蛋白質點經脫色(50%乙腈+50mmol/L碳酸氫銨100μL)、干膠(100%乙腈)、酶解(12.5ng/μL的trypsin酶溶液)、肽段提取(50%乙腈+0.1%TFA 60μL)后，將溶液轉移到96孔板內進行質譜鑒定。質譜分析在復旦大學生命科學學院分析測試中心進行，采用4700MALDI-TOF/TOF Proteomics Analyzer(Applied Biosystems,USA)進行分析。激光源：Nd,YAG激光器(波長355nm)，加速電壓20kV，數據采集采用正離子和數據自動獲取模式。PMF質量掃描范圍700—3500Da，且強度最大的5個峰進行串級質譜分析；用myoglobin酶解肽段作為外標校正譜圖。用GPS(Applied Biosystems,USA)-MASCOT (Matrix,Science,London,UK)數據庫檢索所得結果[9]。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫下水稻根系差異表達蛋白質分析

將提取的各蛋白樣品經過雙向電泳，得到雙向電泳凝膠2-DE圖譜，進一步通過Imagemaster 2D Elite 5.0圖象軟件分析，經自動檢測和人工去除雜點后，每塊膠得到700個左右蛋白質點，各蛋白質的pI范圍為3.5—10.0，Mr范圍為14.4—116.2KD(圖1)。

圖1 不同濃度鎘處理水稻根差異表達圖譜Fig.1 2-DE maps of proteins in rice roots under different Cd2+ concentrationsA、B、C分別為0、50、100μmol/L Cd2+處理下PI312777根蛋白表達圖譜，D、E、F分別為0、50、100μmol/L Cd2+處理下IR24根蛋白表達圖譜;A、D中數字為差異蛋白質點編號

2.2 水稻根系差異表達蛋白的MALDI-TOF-TOF MS分析與鑒定

以0μmol/L Cd2+處理為對照，在抗鎘水稻PI312777和鎘敏感水稻IR24根中都發生差異表達的蛋白質點共有18個(圖1)。對凝膠圖譜中重現性好，Cd2+脅迫下豐度值發生1.5倍以上變化的18個差異蛋白點進行串聯質譜分析，除表達豐度較低而無法檢測的蛋白點外，共有12個蛋白得到鑒定(表1)。其中鎘脅迫下水稻根部關鍵蛋白質的表達情況見表2。

2.3 不同鎘抗性水稻根系的差異蛋白表達模式分析

鎘脅迫處理下，在抗鎘和鎘敏感水稻根部具有相同表達模式的差異表達蛋白6個，包括SMAS、MAT、POD、類萌發素蛋白前體、GTP結合核蛋白Ran-2和GS。其中在不同濃度鎘處理下均發生上調表達的蛋白為SAMS、GTP結合核蛋白Ran-2(表1，表2)；在不同濃度鎘處理下均發生下調表達的蛋白為MAT、POD、類萌發素蛋白前體和GS(表1)。

鎘脅迫處理下，在抗鎘與鎘敏感水稻根部具有不同表達模式的差異表達蛋白6個，包括依賴NADP-GDH、含HVA22域蛋白、ASR5、GDH、60S酸性核糖體蛋白P0和磷酸甘油酸變位酶。其中50μmol/L和100μmol/L Cd2+脅迫下，IR24根部依賴NADP-GDH、GDH和磷酸甘油酸變位酶均發生下調表達，而PI312777根部這3個蛋白僅在100μmol/L Cd2+脅迫下才發生下調表達(表1)；含HVA22域蛋白在PI312777根部發生上調表達，而在IR24根部發生下調表達(表1，表2)；ASR5在PI312777根部上調表達，而在IR24根部的表達量與對照無顯著差異(表1，表2)；在50μmol/L Cd2+脅迫下，60S酸性核糖體蛋白P0在兩種水稻根的表達量未發生變化，在100μmol/L Cd2+脅迫時兩種水稻根部的60S酸性核糖體蛋白P0表達量在水稻PI312777根中減少，在水稻IR24根中增加(表1)。

3 討論與總結

鎘脅迫對植物最重要的傷害是氧化脅迫，這種脅迫導致植物體內活性氧(ROS)增加。ROS一方面誘導清除活性氧相關的酶活性升高，另一方面又可直接攻擊生物大分子，使植物體內酶活性喪失[12]。過氧化物酶(POD)是植物在逆境條件下酶促防御系統的關鍵酶之一，參與植物體內ROS清除。類萌發素蛋白(GLPs)是PRs家族中的一類胞外糖蛋白, 在植物中普遍存在。GLPs主要以酶、受體和結構蛋白的形式參與多種生理生化過程, 能清除植物體內過多的ROS，解除植物的氧化脅迫[13]。MAT催化蛋氨酸和ATP形成S-腺苷甲硫氨酸的反應，是蛋氨酸循環的關鍵酶，而Mg2+和K+是該酶產生活性的重要元素[14]，Cd2+的存在可能會破壞MAT的結構，降低其酶活性。不同濃度鎘脅迫下兩種水稻根系與自由基清除相關的POD、類萌發素蛋白前體和MAT的表達量均下調(表1)，表明水稻根系部分酶的活性喪失，不利于自由基的清除，從而直接影響水稻的生長發育。這與肖美秀等發現鎘脅迫抑制了水稻生長發育的研究結果相吻合[7]。

○無差異表達；↓表達量下調；↑表達量上調

表2 鎘脅迫下水稻根部差異表達的關鍵蛋白質點Table 2 The key proteins were differently expressed in rice root under Cd2+ concentrations

植物通?？梢酝ㄟ^拒絕吸收重金屬或者誘導一些基因表達，產生一些物質直接或間接地參與重金屬結合固定或者把重金屬從敏感的位點移除排除，以增強對重金屬污染的耐性。螯合肽(PCs)是植物體中Cd2+最重要的配體之一，它由谷胱甘肽(GSH)還原合成，結合金屬鎘離子后可將其轉運至液泡，從而減輕金屬在胞液中的毒性。半胱氨酸作為GSH的合成底物，在植物重金屬解毒方面發揮重要作用[15]，S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)可催化甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸，進而形成甲硫氨酸和半胱氨酸[16]，能促進GSH的合成。因此SAMS活性的提高能增強水稻的鎘解毒能力[17-18]。研究表明不同濃度鎘處理誘導了兩種水稻根部的SAMS表達增強，研究結果與Wang等研究鎘脅迫下小麥根系SAMS的表達量顯著增加相一致[19]。谷氨酰胺合成酶(GS)是植物催化谷氨酸鹽(Glu)轉變為谷氨酰胺(Gln)的關鍵酶，在鎘脅迫下該酶活性受到極大的抑制[20]。其活性的降低促進了Glu的積累，有利于鎘解毒物質GSH的生物合成[21]。研究發現鎘脅迫下兩種水稻根系的GS均下調表達，有利于水稻根系鎘解毒的進行。

ASR5和HVA22都是ABA脅迫誘導蛋白，它們的表達水平反映了植物的抗性。ASR5是一類受逆境脅迫(如干旱、低溫、鹽脅迫、ABA 等)后大量表達，以減輕逆境引起的傷害的蛋白質[22]。HVA22是一個ABA脅迫誘導蛋白，它受干旱、鹽和高溫等環境脅迫誘導表達[23]，能抑制赤霉素介導的谷類糊粉細胞的程序性死亡，還能調節脅迫細胞的囊泡轉運，減少植物細胞的非必需分泌，從而提高植物的抗逆境能力[24]。Arenhart 等研究發現Al脅迫下粳稻日本晴的ASR5表達增強[25]，鹽脅迫下耐鹽水稻中的ASR5蛋白上調表達，而在鹽敏感水稻中無顯著變化[26]。大麥幼苗在100μmol/L ABA處理24h，脫水處理3d，或1℃冷處理4d等條件下其HVA22基因均增強表達[23]。本研究發現，不同抗性水稻根中的這兩個蛋白對鎘脅迫產生了不同的表達反應。鎘脅迫下，與對照相比，抗鎘水稻PI312777根部的含有HVA22域蛋白和ASR5蛋白的表達量均增加，而在水稻IR24根部的含有HVA22域蛋白表達卻降低，ASR5的表達量與對照無差異(表1)。表明水稻根中的ASR5和HVA22蛋白的增強表達可能會提高水稻的鎘抗性。

Ran2蛋白被認為是一種重要的細胞分裂調控因子, 參與調控細胞周期中各個時期的許多細胞生命活動, 如細胞核膜重建、DNA復制、RNA轉錄與加工運輸、細胞核質轉運、細胞分裂時紡錘體的組裝等[27]。冷脅迫下水稻OsRAN2基因表達上調，其表達水平與水稻根尖的有絲分裂指數呈顯著正相關，且該基因的過表達提高了水稻的抗寒能力[28]。不同濃度鎘脅迫下兩種水稻根部的GTP結合核蛋白Ran-2均上調表達，促進了根尖的有絲分裂，提高了水稻的鎘耐性。

由以上水稻根響應鎘脅迫的蛋白質表達變化，及前期對鎘脅迫下水稻葉片的蛋白質組學分析結果顯示[16]，水稻根和葉通過了不同的途徑提高自身的抗鎘能力(圖2)。這些途徑的差異有：(1)鎘解毒過程：水稻根部一方面通過增強S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的表達來提高半胱氨酸的含量；另一方面通過降低谷氨酰胺合成酶(GS)的活性來減少Glu轉化為Gln，增加Glu的含量，進而合成更多的GSH用于解除鎘毒害作用。而在水稻葉片則通過提高谷胱甘肽-抗壞血酸偶聯的氧化還原系統中的關鍵酶抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性來消除鎘引起的過氧化氫及其自身的毒害作用。(2)脅迫誘導蛋白的表達存在差異。水稻葉片通過誘導熱激蛋白(HSP)和干旱誘導蛋白的表達來增強自身的鎘抗性。而水稻根部則是提高了具有增強植物抗逆境能力的ABA脅迫誘導蛋白ASR5和HVA22的合成來提升抗鎘能力。(3) 基因表達方面。水稻葉片通過DNA修復重組蛋白來恢復鎘脅迫引起的水稻DNA結構和功能的損傷，維持水稻葉片的正常生長；而在鎘脅迫環境下，水稻根部提高了參與調節細胞核膜重建、DNA復制、RNA轉錄與加工運輸、細胞核質轉運、細胞分裂時紡錘體的組裝等活動的Ran2蛋白的生成，促進水稻根細胞分裂，降低鎘對水稻生長的抑制作用。本研究從蛋白質水平探討了水稻的根和葉在鎘脅迫下的抗性調節過程，有助于加深人們對水稻抗鎘分子機理的認識。

圖2 水稻對鎘脅迫的響應途徑及其在鎘解毒過程中的蛋白質表達變化Fig.2 A putative model of Cd response in rice and possible roles of differently expressed proteins in Cd detoxification

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Analysis of the differently expressed proteins in rice roots in response to cadmium stress

XIAO Qingtie, WANG Jingyuan, ZHENG Xinyu, RONG Hong, ZHANG Guojun,WANG Lianghua, XIE Huiling, LI Yi,CHEN Shan, LIN Ruiyu*, LIN Wenxiong

InstituteofAgroecology,SchoolofLifeSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

To investigate the molecular and physiological responses in rice roots to cadmium (Cd) stress, a set of hydroponic culture experiments treated with Cd2+at0, 50, and 100μmol/L in the solutions were conducted to analyze the differentially expressed proteins in the roots of two rice (OryzasativaL.) cultivars (Cd-tolerant rice PI312777and Cd-sensitive rice IR24) 7days after the treatments.The results showed that 18proteins were differentially expressed in the roots of PI312777and IR24under Cd stress;12of them were identified by the MALDI-TOF/MS technique.The biological functions of these identified proteins were involved in four metabolic pathways, including (1) reactive oxygen species (ROS) stress: peroxidase (POD), methionine adenosyltransferase (MAT), and germin-like protein precursor;(2) glutathione (GSH) synthesis: S-adenosylmethionine synthetase (SAMS), glutamine synthetase (GS), and glutamate dehydrogenase (GDH);(3) stress response induced by abscisic acid (ABA): HVA22and abscisic acid-stress-ripening-inducible 5protein (ASR5);and (4) cell division regulation: GTP-binding nuclear protein Ran-2.Under Cd stress conditions, the expression of SAMS and GTP-binding nuclear protein Ran-2were up-regulated and MAT, POD, the germin-like protein precursor, and GS were down-regulated in the roots of the two rice cultivars.The expression of NADP-GDH, GDH and phosphoglycerate mutase were down-regulated in the roots of rice IR24, but they were down-regulated in PI312777only upon the treatment with 100μmol/L Cd2+.The expression of protein with HVA22domain was up-regulated in PI312777, but it was downregulated reversed in IR24.ASR5was up-regulated in rice PI312777, but no significant change was found in IR24.The 60s acidic ribosomal protein P0was down-regulated in PI312777, but up-regulated in IR24at 100μmol/L Cd2+condition.Our results suggest that Cd stress increases ROS and produces oxidative stress in rice roots, which lead to Cd toxicity in rice roots.To alleviate Cd toxicity, rice roots increase the GSH synthesis by up-regulation of SAMS and GS.Different expression patterns of stress-related proteins such as ASR5and HVA22are important in understanding the differences in Cd tolerance across rice cultivars.

rice (OryzasativaL.);root;cadmium;stress response;proteomics

國家自然科學基金項目(31070403);福建省自然科學基金項目(2009J01056, 2013J01083);福建省教育廳基金項目(JA09084);福建省高校服務海西建設重點項目(0B08B005);福建農林大學重點項目建設專項(6112c0604)

2014-03-23; < class="emphasis_bold">網絡出版日期:

日期:2015-01-28

10.5846/stxb201403230517

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lrylin2004@163.com

肖清鐵, 王經源, 鄭新宇, 戎紅, 張國君, 王良華, 謝惠玲, 李藝, 陳珊, 林瑞余, 林文雄.水稻根系響應鎘脅迫的蛋白質差異表達.生態學報,2015,35(24):8276-8283.

Xiao Q T, Wang J Y, Zheng X Y, Rong H, Zhang G J,Wang L H, Xie H L, Li Y,Chen S, Lin R Y, Lin W X.Analysis of the differently expressed proteins in rice roots in response to cadmium stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(24):8276-8283.