川芎質(zhì)量綜合評價(jià)研究

龔菊梅，張慧，謝媛媛，陳衛(wèi)東，王義明，羅國安

川芎質(zhì)量綜合評價(jià)研究

龔菊梅1,2，張慧2，謝媛媛2，陳衛(wèi)東1，王義明2，羅國安2

目的：綜合考察國產(chǎn)川芎藥材質(zhì)量。方法：用HPLC法測定32批川芎藥材中洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸和藁本內(nèi)酯等5種指標(biāo)成分的含量，并考察藥材TLC鑒別和飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物等藥材常規(guī)理化項(xiàng)目。結(jié)果：除購自新綠色藥業(yè)有限公司山川芎藥材未檢測出洋川芎內(nèi)酯A，其他樣品均能檢測出5種指標(biāo)成分的色譜峰，但含量差異較大，在川芎藥材常規(guī)理化試驗(yàn)結(jié)果中，水分含量和醇浸出物含量符合藥典要求，但總灰分測定中有4批大于6%的含量限度，酸不溶性灰分中有2批大于2%，有2批未檢測出酸不溶性灰分。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同基原、產(chǎn)地和藥用部位的藥材間品質(zhì)差異較大。本實(shí)驗(yàn)為川芎藥材綜合評價(jià)體系的建立提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

川芎；含量測定；阿魏酸；藁本內(nèi)酯；洋川芎內(nèi)酯；高效液相色譜法

川芎是傘形科（Umbelliferae）藁本屬植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根莖，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛之功，為活血化瘀中藥復(fù)方制劑中常用藥材；主要化學(xué)成分為內(nèi)酯類、有機(jī)酸和酚類化合物[1,2]。研究表明：川芎嗪配伍阿魏酸可保護(hù)心肌細(xì)胞缺血再灌注大鼠心肌，明顯降低其血清CK[3]；川芎內(nèi)酯A可保護(hù)缺血/復(fù)氧損傷心肌微血管內(nèi)皮，提高細(xì)胞存活率，減輕損傷[4]；川芎生物堿蒿本內(nèi)酯對子宮平滑肌痙攣具有解痙作用[5]。

為客觀有效表征川芎藥材質(zhì)量，保證其臨床用藥的有效性和安全性，本研究在2010年版《中國藥典》川芎項(xiàng)下檢測項(xiàng)目基礎(chǔ)上，建立了川芎藥材多指標(biāo)成分TLC薄層鑒別方法，進(jìn)行川芎藥材水分、總灰分、酸不溶灰分和醇浸出物鑒別等常規(guī)理化項(xiàng)目測定，同時(shí)使用HPLC法測定32批藥材中洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸和藁本內(nèi)酯等5種指標(biāo)成分含量，以期為川芎藥材綜合評價(jià)體系的建立提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀（系統(tǒng)控制器Prominence CBM-20A，低壓二元梯度泵，SPDM20A檢測器，Prominence SIL-20A自動進(jìn)樣器，高效液相色譜工作站 LCsolution等）；恒溫控制箱（天津譜祥科技有限公司，型號：M500）；RUC-5200型超聲波清洗器（上海睿祺電子設(shè)備有限公司）；PB303-N型電子天平（d=1mg，梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Synthesis 超純水純化系統(tǒng)（美國密理博公司）。

1.2 對照品

阿魏酸（四川維克奇生物科技有限公司，批號201005，純度大于98%）、洋川芎內(nèi)酯A（四川維克奇生物科技有限公司，批號201009，純度大于98%）、Z-藁本內(nèi)酯（四川維克奇生物科技有限公司，批號201103，純度大于98%）、洋川芎內(nèi)酯I（鼎瑞化工有限公司，純度大于98%）和3-正丁烯苯酞（西域化工，純度大于95%）。

1.3 試劑

甲苯（北京第二化工廠，分析純）；鹽酸（北京第二化工廠，分析純）；硝酸銀（北京第二化工廠），冰醋酸（北京第二化工廠，分析純），乙醇（北京第二化工廠，分析純）；甲醇（J.T.Baker，色譜純），水為Milli-Q超純水。

1.4 藥材

川芎對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120918-200809），本研究所用32批川芎藥材產(chǎn)地均來自四川省的不同地區(qū)，經(jīng)鑒定均為傘形科（Umbelliferae）藁本屬植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根莖，其中兩批山川芎也為川芎的一種。32批川芎藥材來源見表1 。

2 方法

2.1 3種指標(biāo)成分TLC鑒別

按照2010年版《中國藥典》（一部）川芎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下薄層色譜鑒別法鑒定[6]。

對照品溶液的配制：取歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A對照品，加乙酸乙酯制成每1ml含0.1mg的溶液（置棕色量瓶中），作為對照品溶液。

2.2 川芎飲片水分、總灰分、酸不溶灰分、醇浸出物測定

水分、總灰分、酸不溶灰分按照2010年版《中國藥典》（一部）川芎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下相關(guān)方法測定（附錄IX H、K）。醇浸出物按照2010年版《中國藥典》（一部）附錄X A醇溶性浸出物測定法中熱浸法，以乙醇為溶劑進(jìn)行測定。

2.3 阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞HPLC含量測定

2.3.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱：Grace Allitma C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流速：1.0ml/min；檢測波長：280nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣：20μL；流動相：0.2%冰醋酸-水（A）-甲醇（B）；梯度洗脫（0-3min, 32% B; 3-60min, 32%～85% A; 60-65min, 85%～95% A)。理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.3.2 對照品溶液的配制 取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞對照品適量，加甲醇制備成每1mL各含阿魏酸0.502mg、洋川芎內(nèi)酯I 2mg、洋川芎內(nèi)酯A 1mg、藁本內(nèi)酯2mg、3-正丁烯苯酞0.493mg的混合對照品儲備液。精密吸取適當(dāng)體積的對照品儲備液，分別制備成濃度范圍為阿魏酸：6.275～251.0μg．mL-1、洋川芎內(nèi)酯I：10.00～400.0μg．mL-1、洋川芎內(nèi)酯A：6.250～200.0 μg．mL-1、藁本內(nèi)酯：25.00～800.0μg．mL-1、3-正丁烯苯酞：12.325～493.00μg．mL-1的6個(gè)不同濃度水平的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取上述溶液20 μL，各進(jìn)樣2次。

2.3.3 供試品溶液的配制 取川芎中粉0.5 g（過4號篩）， 精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入30 mL50%乙醇，超聲處理45 min （40 kHz, 500W），放冷，定容至50 mL，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4 測定法 精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液20μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法測定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞含量。

3 結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)藥材樣品來源一覽表

18 川芎 鑫寶堂藥業(yè)有限公司 飲片 四川敖平 2010年12月19 川芎 吉林敖東 飲片 四川 2005年12月20 川芎 敖平 飲片 四川敖平 2009年12月21川芎 重慶 藥材 四川 2009年12月22 川芎 鑫寶堂藥業(yè)有限公司 藥材 四川都江堰 2010年12月23 川芎 鑫寶堂藥業(yè)有限公司 飲片 四川敖平 2009年12月24 川芎 鑫寶堂藥業(yè)有限公司 飲片 四川敖平 2010年12月25 川芎 北京同仁堂 飲片 四川 2010年12月26 川芎 重慶桐君大藥房 飲片 四川 都江堰 2010年12月27 川芎 成都荷花池 飲片 四川 2010年12月28 川芎 敖平 飲片 四川 敖平 2010年12月29 川芎 新綠色藥業(yè)有限公司 藥材 四川敖平 2010年12月30 川芎 重慶和平大藥房 飲片 四川 2010年12月31 川芎 鑫寶堂藥業(yè)有限公司 飲片 四川 2005年12月32川芎 浙江 飲片 四川 2009年12月

3.1 3種指標(biāo)成分的TLC鑒別及飲片的水分、總灰分、酸不溶灰分、醇浸出物測定結(jié)果

32批藥材中歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A等TLC鑒別結(jié)果見圖1，對照品相應(yīng)位置上均檢測到相應(yīng)斑點(diǎn)，常規(guī)理化測定結(jié)果見表2。

圖1 32批川芎藥材254nm下薄層色譜圖

表2 川芎藥材的測定結(jié)果

22 藥材/川芎 5.37 4.42 0.34 40.7 5.06 4.74 0.94 0.79 22.17 33.69 23 藥材/川芎 6.42 4.34 0.56 38.7 1.42 8.09 0.95 1.61 48.37 60.45 24 川芎片/川芎 8.33 4.33 0.08 22.6 3.87 6.24 1.13 2.08 50.46 63.78 25 飲片/川芎 7.92 4.29 0.44 31.9 2.15 4.94 0.73 1.67 27.89 37.39 26 飲片/川芎 7.20 4.27 0.75 26.0 2.64 8.18 0.84 1.21 36.03 48.91 27 飲片/川芎 6.79 4.27 0.31 28.3 2.30 10.85 0.71 1.88 46.4 62.14 28 藥材/川芎 5.14 4.25 0.80 32.7 2.22 16.91 0.86 2.54 54.44 76.98 29 藥材/川芎 8.72 4.23 - 33.3 2.71 2.47 0.55 0.63 9.776 16.14 30 飲片/川芎 5.98 4.02 0.31 26.4 4.95 4.20 1.08 1.46 29.12 40.81 31 川芎片/川芎 7.87 3.76 0.69 26.6 3.57 4.36 1.12 1.32 23.53 33.89 32 飲片/川芎 4.00 3.40 0.36 27.8 1.12 5.73 0.91 1.13 24.68 33.57 Max 10.2 7.94 3.16 40.7 7.28 16.91 1.44 2.54 68.54 79.34 Min 2．82 3．40 0．17 16．7 1．12 2．47 0．44 0．63 9．776 16．14 RSD 28．6 19．1 74．5 23．3 49．9 50．96 23．37 32．31 41．19 35．07 Average+ 6．49± 4．93± 0．85± 29．6± 3．20± 5．66± 0．95± 1．44± 32．93± 44．19± SD 1．82 0．93 0．62 6．27 0．29 0．53 0．04 0．09 2．48 2．82

3.2 川芎藥材中5種指標(biāo)成分HPLC含量測定結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”各對照品溶液，按測定法進(jìn)樣分析。以對照品濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸。5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表3。

表3 川芎藥材中5種指標(biāo)成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取川芎樣品，連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)樣量20μL，計(jì)算洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量，得到其含量RSD值分別4.67%、2.46%、5.43%、4.64%、3.72%，均小于6.0%，說明儀器的精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取室溫下放置的川芎樣品溶液，每隔3個(gè)小時(shí)進(jìn)同一針樣品，進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為20μL，結(jié)果洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量的RSD值分別為1.37%、4.28%、1.11%、1.14%、4.17%，均小于5.0%，說明供試品在15h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取川芎藥材按供試品制備方法平行制備供試品6份，進(jìn)樣20μL，計(jì)算洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的含量，其RSD值分別為2.87%、2.89%、2.83%、1.75%、1.17%，均小于3.0%，說明方法重復(fù)性良好。

3.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的川芎藥材6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞對照品各0.36 mg、0.54 mg、0.12 mg、0.27 mg和4.75 mg。按供試品溶液制備方法制備，每份進(jìn)樣20 μL，測定樣品中含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4，各指標(biāo)成分的平均回收率為100.1%～104.2%。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

0.12 0.12 108.3 3-正丁烯苯酞0.12 0.13 108.3 0.12 0.12 108.3 0.12 0.12 100.0 0.12 0.13 108.3 0.12 0.13 108.3 104.2 4.4 0.27 0.27 100.0阿魏酸0.27 0.26 96.3 0.27 0.28 103.7 0.27 0.29 107.4 0.27 0.30 111.1 0.27 0.28 103.7 103.7 5.05 4.75 4.79 100.8 4.75 4.69 98.7 4.75 4.75 100.0 4.75 4.79 100.8 4.75 4.75 100.0 4.75 4.75 100.0藁本內(nèi)酯100.1 0.77

3.2.6 川芎藥材中5種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果 按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備不同批號的供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，平行測定3次，計(jì)算樣品中5種指標(biāo)成分的含量，含量測定結(jié)果見表2、圖2。

圖2 川芎藥材高效液相色譜圖

4 討論

4.1 32批川芎藥材中指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果表明，若僅以阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)，32批川芎藥材均能滿足2010年版藥典中阿魏酸含量大于0.1%的規(guī)定。研究表明，洋川芎內(nèi)酯A和Z-藁本內(nèi)酯作為川芎的揮發(fā)油成分，具有活血通絡(luò)，散風(fēng)止痛等功效。所以單純以阿魏酸作為含量測定指標(biāo)不能全面有效地控制川芎的制劑質(zhì)量。

4.2 從表1中可以看出，32批藥材中5種指標(biāo)成分的含量差異較大。其中藁本內(nèi)酯的含量最高，阿魏酸和3-正丁烯苯酞的含量較低。從上海購買的川芎藥材中藁本內(nèi)酯的含量最大（79.34 mg/g），采自四川彭州的藥材中洋川芎內(nèi)酯I的含量最大（7.28 mg/g），來自吉林敖東的川芎飲片中3-正丁烯苯酞的含量最高（1.44mg/g），采自四川敖平的川芎飲片中洋川芎內(nèi)酯A和阿魏酸的含量最高（分別為16.91 mg/g和2.54 mg/g），來自于新綠色藥業(yè)的川芎藥材中藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和阿魏酸的含量均為最低（分別為 9.78mg/g 、2.47mg/g 、0.63 mg/g）。綜合以上考慮，建議以總平均含量的80%作為5種指標(biāo)成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（草案）含量標(biāo)準(zhǔn)測定項(xiàng)下。即藁本內(nèi)酯、阿魏酸、3-正丁烯苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I的最低限量分別為26.34 mg/g、1.152 mg/g、0.76 mg/g、4.53 mg/g、2.56 mg/g。

4.3 川芎常規(guī)理化測定結(jié)果表明，32批川芎藥材中水分和醇浸出物含量結(jié)果均符合2010版藥典規(guī)定的不高于12.0%（max 10.2%）和不低于12.0%（min 16.7%）的要求。32批藥材中灰分含量測定范圍在3.40%～7.94%，其中4批灰分含量超出了2010版藥典規(guī)定的6.0%限度；酸不溶性灰分含量測定范圍為0.17%～3.16%，其中兩批未檢測出酸不溶性灰分，兩批藥材的含量超出了藥典規(guī)定的2.0%的限度。

4.4 實(shí)驗(yàn)中考察了提取方式（超聲法、回流法）、提取溶劑（甲醇、無水乙醇、水）、溶劑濃度（30%、50%、90%）、溶劑用量（60、100、200倍）和提取時(shí)間（13、30、45min），最終確定以60倍溶劑用量、50%無水乙醇為提取溶劑、超聲提取法、提取45min為最終提取條件。此條件操作簡單，資源消耗最少，提取效率最高。

[1] Xiaozhen zhang,Hongbinxiao,Qing xu,et al.Characterization of phthalides in Ligusticum chuanxiong by Liquid chromatographic-Atmospheric Pressure Chemical Ionization-Mass Spectrometry[J].Journal of Chromatographic Science, 2003,41:428.

[2] 北京制藥工業(yè)研究所.川芎有效成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1979,11(11):670.

[3] 潘贊紅,金鑫.川芎嗪與阿魏酸配伍對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用[J].天津醫(yī)藥,2008,10(36):796.

[4] 高偉,梁日欣,肖永慶,等.川芎內(nèi)酯A預(yù)處理對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國中藥雜志,2007,32(2):133.

[5] 忻志鳴,周曉明.川芎制劑的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].河北醫(yī)藥,1999,21(1):41.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

（責(zé)任編輯：蔣淼）

Systematic quality evaluation of Chuanxiong

GONG Ju-mei1,2,ZHANG Hui2, XIE Yuan-yuan2, CHEN Wei-dong1, WANG Yi-ming2, LUO Guo-an2//(1.Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031,Anhui; 2.Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084 ,China)

Objective:To systematically evaluate the quality of Chuanxiong produced in China.Method:The contents of 5 marker compounds in 32 samples of Chuanxiong were analyzed by HPLC method. The identifcation method of 5 marker compounds in Chuanxiong was developed by TLC. Some physical and chemical tests (H2O, total ash, acid insoluble ash and EtOH extract) were done to investigate their qualities.Result:5 marker compounds were found in 32 samples. There were signifcant differences in contents of the 5 marker compounds as well as physical and chemical parameters.Conclusion:The study provides theoretical and experimental data for the systematic quality evaluation of Chuanxiong in China.

Chuanxiong; quality evaluation; ferulic acid; ligustilide; senkyunolide; HPLC

R 284.1

A

1674-926X(2015)04-001-05

重大新藥創(chuàng)制（2014ZX09304307001-010）中藥新藥安全性檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084

龔菊梅（1988-），女，碩士在讀，從事藥劑學(xué)研究 Tel:13718053176 Email:gongjumei@163.com

謝媛媛（1980-），女，博士，高級工程師，研究方向：中藥質(zhì)量控制Tel:010-62772265 Email:yuanyuan8078@gmail.com

2014-12-01