小鼠心肌微血管內皮細胞的原代培養及鑒定＊

任麗蓉 何藺 劉濤 王浩宇

（1.四川醫科大學附屬醫院心內科，四川 瀘州 646000；2.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院心內科，四川 南充 637000）

微血管內皮細胞不僅構成了血液與組織間的重要屏障，參與物質交換，同時微血管內皮細胞還具有合成、分泌和降解生物活性物質的功能［1］。在對內皮細胞的不斷研究中，發現微血管內皮細胞的功能損害是糖尿?。?］、感染［3］、纖維化［4］、休克及腫瘤等多種疾病的病理基礎［5］。微血管內皮細胞的功能不同于大血管內皮細胞［6］，因此在對內皮細胞的研究中必須區分二者的差異。另外，不同的組織器官微血管內皮細胞的功能具有特異性。目前國內外已有相當的文獻報道了不同組織器官的微血管內皮細胞的分離培養方法，但是小鼠心肌微血管內皮細胞（mouse cardiac microvascular endothelial cells，MCMECs）的分離培養方法仍不成熟。本實驗介紹一種可以避免膠原酶等消化酶的化學損傷，同時又簡單可行、重復性好且經濟節約的小鼠心肌微血管內皮細胞培養方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3～4周大小的SPF 級雄性C 57小鼠，購自成都達碩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco公司，明膠（gelatin）購自Sigma公司，內皮細胞專用培養基（endothelial cell medium，ECM）購自Sciencell公司，0.25%胰蛋白酶溶液、低糖／DMEM 培養基和青霉素／鏈霉素混合液購自Hyclone公司，兔抗小鼠vWF 相關抗原多克隆抗體（Ⅰ抗）購自Santa Cruz，Matrigel膠購自BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌微血管內皮細胞的原代培養 MCMECs的分離參照相關文獻［7，8］并改進。將5～8只C 57小鼠脫頸法處死，全身于75%酒精溶液中浸泡3～5min后，無菌條件下逐層打開胸腔，迅速取出心臟并置于含有1%青／鏈霉素混合液和適量肝素鈉的低糖／DMEM 培養基中清洗干凈。將清洗干凈的小鼠心臟轉移至冰袋上盛有低糖／DMEM 培養基的培養皿中，小心去除左右心房、瓣膜組織和結締組織，將余下的心室組織用70%［9］的酒精浸泡15s，以滅活心肌內外膜細胞。PBS 溶液徹底清洗心室組織，吸棄多余的PBS溶液后滴加少量FBS至余下的心肌組織中，然后用眼科剪快速地將其剪切為1mm×1mm×1mm 大小的組織塊。將剪碎的組織塊均勻地接種至1%明膠包被的6孔板中，將6孔板放入37℃5% CO2的培養箱中孵育60min 使組織塊牢固貼壁后，輕輕追加2mlECM（含5%FBS＋1% 內皮細胞生長添加物ECGS＋1%青霉素／鏈酶素混合液）完全培養基繼續培養。約24小時后可見組織塊周圍有細胞爬出，48小時后第1次換液，約65小時后去除組織塊繼續培養貼壁細胞。以后每2天換液1次，大約1周后細胞匯合呈單層。

1.3.2 小鼠心肌微血管內皮細胞的傳代培養 原代MCMECs生長至6孔板底面積的80%～90%時吸棄舊培養基并用PBS溶液清洗6孔板3次后，每孔加入適量37℃預熱的0.25%胰蛋白酶液，倒置顯微鏡下觀察，當細胞收縮變圓，細胞間隙增大時立即加入含10%FBS的低糖／DMEM 培養基終止消化。吸管輕輕吹打6孔板底面至細胞全部脫落后，將細胞懸液轉移至15ml離心管中，1200r／min 離心3min。去掉離心管內液體，加入適量ECM 完全培養基后輕輕吹打均勻，將重懸的細胞按1∶2比例傳代至1%明膠包被的培養皿中，置于37℃5% CO2培養箱中培養24 小時后首次換液，以后每2天換液1次。

1.3.3 小鼠心肌微血管內皮細胞的生長曲線繪制取對數生長期的第二代小鼠心肌微血管內皮細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2×104個細胞接種至明膠包被的24孔板中，從第二天開始將每3個孔作為1組進行細胞計數，取平均值，直到將所有組的細胞計數完畢，共8天，以細胞生長天數（d）為橫坐標，所得的平均細胞數為縱坐標繪制細胞生長曲線圖。

1.3.4 小鼠心肌微血管內皮細胞的鑒定 取第二代或第三代對數期生長的MCMECs細胞，0.25%胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，接種至盛有無菌蓋玻片的24孔板中。當細胞爬滿蓋玻片面積的70%～80%時，用PBS溶液清洗3次，每次3min；接著用4%的多聚甲醛固定30min 后用PBS 溶液清洗3 次，每次3min；然后用0.1%的Tritionx－100室溫孵育15min，PBS洗3次，每次3min。每張細胞爬片上滴加適量的正常山羊血清室溫封閉1小時后，滴加適量兔抗小鼠vWF多克隆抗體（Ⅰ抗，1∶100）至爬片剛好被抗體覆蓋，將爬片放入濕盒中4℃過夜，PBS溶液洗3次，每次3min，滴加適量FITC 標記的羊抗兔IgG（Ⅱ抗，1∶100），室溫避光孵育1小時后用PBS溶液清洗3次，每次3min，最后用DAPI染核，室溫避光孵育15min，同時做空白對照，用PBS代替Ⅰ抗，余步驟相同。用熒光抗淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 體外小管形成實驗 4℃冰箱融化Matrigel膠，48孔板和200μl槍頭提前預冷。按每孔100μl將Matrigel膠加至48 孔板內，不要產生氣泡，37℃5%CO2培養箱中過夜孵育使膠凝固后，按2×104個細胞每孔加入48孔板內，細胞接種后分別于6、12、24h在倒置顯微鏡下拍照，動態觀察MCMECs的體外小管形成過程。

2 結果

2.1 小鼠心肌微血管內皮細胞的形態學觀察 組織塊貼壁后24小時開始有少量細胞爬出，成梭形、三角形或多角形（圖1A）；培養1周左右可匯合成單層，呈典型的鋪路石樣（圖1B）。傳至第三代后在明膠包被的培養皿中細胞仍呈梭形、多角形、鋪路石樣和管腔樣生長（圖1C），細胞傳至3代內的形態和性狀未發生明顯變化。

2.2 小鼠心肌微血管內皮細胞的生長曲線 MCMECS的生長曲線近似“S”形，表現為傳代后的MCMECs第1、2天生長速度比較緩慢，第3、4天時生長速度增快，進入對數生長期，第5～7天時達到匯合狀態，第7、8天細胞數量不再增加，進入停滯期（圖2）。說明分離得到的MCMECs的生長具有潛伏期、對數生長期和接觸抑制的特性。

2.3 小鼠心肌微血管內皮細胞的免疫熒光鑒定 爬片的細胞經vWF和DAPI免疫化學染色后可見胞漿呈綠色熒光，核呈藍色熒光（圖3），說明分離培養的細胞陽性表達vWF，陽性染色率達90%以上，證明該實驗所獲細胞為小鼠心肌微血管內皮細胞。

2.4 體外小管形成實驗 將MCMECs接種到Matrigel膠后6 小時可觀察到細胞已貼壁，并且細胞開始聚集形成不明顯的管腔樣結構（圖4A），12 和24h時細胞已經形成明顯的具有三維結構的小管結構，并相互交織成網絡狀（圖4B和C），可見分離得到的微血管內皮細胞具有小管形成能力。

圖1 MCMECs的原代培養和傳代培養（×100）Figure 1 Primary culture and subculture of MCMECs

圖2 MCMECs的生長曲線Figure 2 The growth curve of MCMEC

圖3 vWF相關抗原的免疫熒光鑒定（×400）Figure 3 Identification MCMECs by vWF

圖4 MCMECs的體外小管形成實驗（×100）Figure 4 The tube formation of MCMECs

3 討論

Nishida等［10］使用膠原酶與胰蛋白酶聯合消化法成功分離出大鼠心肌微血管內皮細胞后，國內外多采用該法分離培養心肌微血管內皮細胞。之后，Chen等［11］報道了另一種培養微血管內皮細胞的方法，即組織塊貼壁法，該法不僅操作簡單，還可以避免消化酶對細胞的化學損傷。后來國內也有使用組織塊貼壁法成功培養出大鼠心肌微血管內皮細胞的報道［8，12，13］。而對于小鼠心肌微血管內皮細胞的培養，目前報道的方法主要還是采用酶消化法［14～16］。但由于小鼠心肌微血管內皮細胞的培養難度大，且尚無成熟的細胞系，因此有必要建立一種簡單有效的小鼠心肌微血管內皮細胞培養方法。

組織塊貼壁法培養細胞成功的關鍵就是使組織塊充分貼壁。本實驗方案在剪切心室肌組織時加入了少量的FBS，不僅可以營養心肌組織，避免組織塊干燥，且FBS還有促進組織塊貼壁的作用；另外，培養細胞的6孔板和培養皿預先用1%的明膠包被也具有促進組織塊貼壁的作用。組織塊貼壁后最先游離出的細胞是紅細胞，接著內皮細胞開始游出，成纖維細胞等雜細胞要72小時后才開始游出［11］。據此本實驗在65 小時的時候去除組織塊，既可以使心肌微血管內皮細胞充分游出，又避免了成纖維細胞的污染，并且整個培養過程都使用內皮細胞專用培養基培養，該培養基的血清濃度低且含內皮細胞促生長物質，因此該培養基在促進心肌微血管內皮細胞游出和生長的同時，可以抑制成纖維細胞的游出和分裂增殖。由于紅細胞基本不貼壁，且無分裂增殖能力，在以后的換液和傳代過程中可逐步清除，如此可獲得較高純度的心肌微血管內皮細胞，因為該法操作步驟簡單，流程短，還可以減少操作過程中的污染機會。

4 結論

本實驗提供了一種操作簡便、經濟節約且細胞獲得量大、活性好、純度高的小鼠心肌微血管內皮細胞培養方法，小鼠心肌微血管內皮細胞的成功培養將為微血管病變的研究提供了實驗所需的細胞來源，并可促進心血管疾病研究的發展。

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