瑞舒伐他汀通過激活SGK1上調(diào)ALI小鼠ENaC表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究＊

馮社軍 王慧娟 李軍濤 武艷強(qiáng) 朱濤

（1.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室／呼吸內(nèi)科，四川 成都 610041）

非心源性肺水腫（non－cardiac pulmonary edema）是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS）最重要的病理特點(diǎn)之一，也是ALI／ARDS 最特征性的病理生理學(xué)改變［1～4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS狀態(tài)下非心源性肺水腫是導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一，也是導(dǎo)致早期ARDS患者死亡的主要因素［1～4］。研究證實(shí)，改善肺水腫可以有效改善肺順應(yīng)性和肺換氣功能，降低ALI模型動(dòng)物的死亡率。大量研究表明，他汀類藥物具有獨(dú)立于降脂以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學(xué)活性［5～8］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)他汀可以有效促進(jìn)血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1（SGK1）的活化［7］。由于SGK1是調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞ENaC的關(guān)鍵分子，實(shí)驗(yàn)表明，激活SGK1可有效上調(diào)ALI狀態(tài)下肺上皮細(xì)胞ENaC 的表達(dá)而改善肺水腫［3］。本文探討在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀能否通過上調(diào)肺組織ENaC 的表達(dá)改善肺水腫的嚴(yán)重程度及相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料 SPF 級(jí)雄性C57BL／6小鼠30只，6～10周齡，體重約18～22g，購于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。電泳單元及電泳附件、電源、濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)由Bio－rad公司提供。瑞舒伐他汀購于瑞典阿斯利康制藥有限公司；大腸埃稀桿菌內(nèi)毒素（LPS）購自美國Sigma公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒和PCR 試劑盒購自美國Mbi Fermentas公司；兔抗鼠α－ENaC 抗體、兔抗鼠β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）抗體、兔抗鼠phospho－SGK1抗體以及兔抗鼠SGK1 抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型的建立 30 只雄性C57BL／6大鼠隨機(jī)平均分為對(duì)照組（Control組）、干預(yù)組（LPS＋ROS 組）和模型組（LPS 組），每組10只。腹腔注射戊巴比妥（30mg／kg）麻醉小鼠。干預(yù)組和模型組小鼠通過氣道內(nèi)注射LPS（10μg LPS溶于50μl生理鹽水）誘導(dǎo)建立ALI模型［1］。注入LPS前2小時(shí)，干預(yù)組給予口服瑞舒伐他汀（30mg／kg），每日1次；對(duì)照組給予生理鹽水代替LPS。于干預(yù)72 小時(shí)后下腔靜脈放血處死小鼠。

1.2.2 HE染色觀察病理變化并進(jìn)行肺損傷評(píng)分取左下肺組織，常規(guī)制成5μm 的石蠟切片，HE 染色觀察肺損傷程度，并進(jìn)行肺損傷評(píng)分［1］。

1.2.3 肺組織濕／干比（wet to dry ratio，W／D）測(cè)定小鼠處死后取出肺組織。將小鼠右下肺置于80℃烤箱24 小時(shí)至恒重后，記錄前后肺組織重量，計(jì)算W／D 比值。

1.2.4 RT－PCR 法檢測(cè)α－ENaC mRNA 表達(dá) 取左上肺組織，按照試劑盒說明書提取總RNA。引物：α－ENaC 正 義：5′－TCACTTCAGCA CATCTTC CACAGCTGC－3′，反 義：5′－GTATCTGC CTAGCTGGTC CAAGTGGGA－3′；β－actin 引 物：正 義：5′－CGAGCGGGC TACAG CTTC－′，反 義：5′－GTCACGC ACGATTC CCTCT－3′，按照試劑盒說明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－rad）攝影，Quantity One軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。用α－ENaC／β－actin PCR 產(chǎn)物條帶灰度比值作為α－ENaC mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)肺組織α－ENaC 蛋白表達(dá)和SGK1活化水平 按照試劑盒操作要求，首先提取肺組織總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別加入兔抗鼠α－ENaC抗體（1∶1000）、兔抗鼠β－actin抗體（1∶2000）、兔抗鼠phospho－SGK1抗體（1∶1100）以及兔抗鼠SGK1抗體（1∶1100），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000），用ECL 進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化和肺損傷評(píng)分 在干預(yù)72小時(shí)后，獲取小鼠肺組織，HE 染色后光鏡觀察。對(duì)照組小鼠肺組織未見病理改變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無紅細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔，無透明膜形成；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚，肺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡和肺間質(zhì)大量水腫液聚集，肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，肺泡中透明膜形成；干預(yù)組小鼠肺組織病理改變相對(duì)較輕，主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)性肺水腫形成，僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細(xì)胞，并可見少量透明膜。進(jìn)行肺損傷評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠肺組織損傷評(píng)分高于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 小鼠肺組織損傷評(píng)分和W／D值（）Table 1 Lung injury scores and W／D ratio in mice

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

2.2 肺組織濕干比（W／D 比值）在干預(yù)72小時(shí)后，LPS干預(yù)小鼠肺組織W／D 比值較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但干預(yù)組小鼠肺組織的W／D 比值較模型組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 肺組織α－ENaC 的表達(dá)水平 使用RT－PCR 和western blot對(duì)肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)72小時(shí)后小鼠肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織α－ENaC表達(dá)量較模型組小鼠升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 肺組織α－ENaC表達(dá)RT－PCR和western blotting結(jié)果Figure 2 The RT－PCR and western blot results ofα－ENaC in each group

表2 肺組織α－ENaC mRNA 和蛋白的表達(dá)水平及SGK1的活化水平（）Table 2 The mRNA and protein expression ofα－ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

表2 肺組織α－ENaC mRNA 和蛋白的表達(dá)水平及SGK1的活化水平（）Table 2 The mRNA and protein expression ofα－ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

2.4 肺組織SGK1活化水平 使用western blot對(duì)肺組織中SGK1 活化水平（phospho－SGK1／total SGK1）分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)72小時(shí)后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 肺組織SGK1活化水平結(jié)果Figure 3 The activity of SGK1results in lungs

3 討論

急性肺損傷（ALI）是一種由多種嚴(yán)重的肺內(nèi)或肺外疾病，如重癥肺炎、肺膿腫、嚴(yán)重膿毒血癥和休克等導(dǎo)致的失控和自我放大的、以肺組織為中心的炎癥反應(yīng)［1～4，9］。急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）是其更加嚴(yán)重的狀態(tài)。目前流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究結(jié)果表明，ARDS的病死率高達(dá)35%～50%，尋求新的治療方法和藥物具有重要的價(jià)值和意義［4］。非心源性肺水腫（non－cardiac pulmonary edema）是ALI／ARDS 最重要的病理改變之一，也是ALI／ARDS 最特征性的病理生理改變［1～4，9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，非心源性肺水腫是導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一，也是導(dǎo)致早期ARDS 患者死亡的主要因素［1～4，9］。研究證實(shí)，改善肺水腫可以有效改善肺順應(yīng)性和肺換氣功能，降低ALI 模型動(dòng)物的死亡率［1～4，9］。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類（statin）藥物包括瑞舒伐他汀（rosuvastatin）和辛伐他汀（simvastatin）等具有獨(dú)立于降脂以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學(xué)活性［5～8，10］。Zhu T 等研究證實(shí)，瑞舒伐他汀可以通過抑制炎癥反應(yīng)下調(diào)OVA 誘導(dǎo)的小鼠氣道粘液的分泌［6］。Duivenvoorden R 等的研究發(fā)現(xiàn)，他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥反應(yīng)有明顯地抑制作用［10］。我們的實(shí)驗(yàn)表明，LPS誘導(dǎo)72小時(shí)后小鼠肺組織出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚，肺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡和肺間質(zhì)大量水腫液聚集，肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，肺泡中透明膜形成。而瑞舒伐他汀進(jìn)行干預(yù)后，小鼠肺組織病理改變明顯減輕，主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)性肺水腫形成，僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細(xì)胞，并可見少量透明膜。進(jìn)一步肺損傷評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組小鼠肺組織損傷評(píng)分顯著低于LPS組。對(duì)肺水腫嚴(yán)重程度進(jìn)行分析后也發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)后小鼠肺組織W／D 比值較對(duì)照組明顯增加，但瑞舒伐他汀干預(yù)后小鼠肺組織的W／D 比值較模型組更低。以上結(jié)果表明，瑞舒伐他汀可以明顯減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型肺組織炎癥反應(yīng)和肺水腫。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)［3，9，11］，肺水腫的形成和清除與肺上皮細(xì)胞表達(dá)的鈉離子通道（ENaC）密切相關(guān)，ENaC是肺泡液體清除的關(guān)鍵和限速環(huán)節(jié)，其表達(dá)和功能的異常是導(dǎo)致ARDS非心源性肺水腫的重要原因。ENaC由α、β和γ3種亞基構(gòu)成，ENaC 在肺泡I型和II型上皮細(xì)胞上廣泛表達(dá)，而α亞基是ENaC 的功能亞基，β和γ 亞基對(duì)ENaC 活性具有調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)72小時(shí)后，小鼠肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白的表達(dá)量明顯下降，但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織α－ENaC表達(dá)量較模型組小鼠升高，提示在ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀能夠通過促進(jìn)ENaC的表達(dá)改善肺水腫。

另有研究證實(shí)，SGK1 是調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞ENaC表達(dá)的關(guān)鍵分子，促進(jìn)SGK1 磷酸化（即SGK1 的活化）對(duì)于調(diào)節(jié)ENaC 的表達(dá)具有重要作用［12］。Zhu T等的研究表明，LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠模型中促進(jìn)SGK1磷酸化可以通過上調(diào)肺組織中ENaC 以減輕肺水腫的嚴(yán)重程度［3］。Zhang L 等研究表明，他汀類藥物也可誘導(dǎo)SGK1 磷酸化的發(fā)生［7］。本實(shí)驗(yàn)中我們使用western blot法對(duì)SGK1 的活化水平（phospho－SGK1／total SGK1）進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)72小時(shí)后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對(duì)照組明顯下降，但給予瑞舒伐他汀干預(yù)的小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組小鼠升高。提示在ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀可以誘導(dǎo)肺組織中SGK1的活化。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀可以通過增加肺組織ENaC 的表達(dá)有效地改善肺水腫嚴(yán)重程度，并發(fā)現(xiàn)該機(jī)制與促進(jìn)SGK1的活化密切相關(guān)。這為他汀類藥物應(yīng)用于ARDS的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

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