一種gRNA快速合成及檢測(cè)方法的建立

杜建勇，鄧然，高虹，雍偉東

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

基因定點(diǎn)敲除技術(shù)通過對(duì)染色體上基因特異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其功能喪失，進(jìn)而達(dá)到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技術(shù)創(chuàng)建的動(dòng)物疾病模型對(duì)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)于上世紀(jì)80年代末由Smithies 等［1］創(chuàng)立，通過同源重組手段將構(gòu)建的外源DNA 片段插入并替換相應(yīng)染色體上特定的區(qū)段，達(dá)到基因敲除的目的。這一技術(shù)的應(yīng)用使人類能夠有目的地研究基因功能和與之相關(guān)的疾病之間的直接關(guān)系。然而由于同源重組技術(shù)需要載體構(gòu)建、ES 細(xì)胞打靶、篩選、顯微注射、小鼠鑒定等一系列較為復(fù)雜的操作步驟，并且成本較高、周期較長(zhǎng)，大大限制了這一技術(shù)的應(yīng)用。針對(duì)同源重組的缺點(diǎn)，科學(xué)家一直在探索用其他更簡(jiǎn)便的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)基因敲除。先后發(fā)明了ENU 隨機(jī)突變、基因捕獲、ES 細(xì)胞基因敲除細(xì)胞庫等方法和手段，但由于技術(shù)手段和操作成本的限制，這些技術(shù)都不能完全替代傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)。2009年以后出現(xiàn)了一系列新的基因編輯技術(shù)，包括ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas9，開創(chuàng)了基因敲除(敲入)新的時(shí)代。這些新基因編輯技術(shù)作用原理相似，即通過核酸酶在目的基因的DNA 雙鏈上制造切口，然后利用生物體自身的修復(fù)機(jī)制以同源重組或者非同源末端連接的方式實(shí)現(xiàn)修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到基因失活的目的。作為一種最新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)通過gRNA 識(shí)別特異的靶序列，同時(shí)介導(dǎo)Cas9 核酸酶在DNA 的特異位點(diǎn)上制造切口［2］，然后利用生物體自身的修復(fù)機(jī)制進(jìn)行DNA 修復(fù)。這一過程中可能造成堿基改變、增加、缺失等突變現(xiàn)象，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除與修飾［3］。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被成功應(yīng)用于多種生物。包括人類細(xì)胞［4］，斑馬魚［5］、小鼠［6，7］、大鼠［8］、植物［9，10］及細(xì)菌［11］。眾所周知，生物體的一個(gè)性狀往往由多個(gè)基因共同決定，傳統(tǒng)的基因敲除費(fèi)時(shí)費(fèi)力卻只能一次敲除一個(gè)相關(guān)基因，而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)其中一個(gè)最重要的特點(diǎn)便是可在多個(gè)不同gRNA 的引導(dǎo)下由Cas9 核酸酶一次靶向敲除多個(gè)基因組位點(diǎn)［12，13］。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):首先，其RNA 識(shí)別DNA 機(jī)制即核酸之間的相互識(shí)別，避免了DNA 甲基化造成的影響。其次，與ZFN 和TALEN 相比，具有相同或更高的基因編輯效率，尤其在點(diǎn)突變方面優(yōu)于ZFN 和TALEN［14，15］。第三，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單快速，無需重復(fù)構(gòu)建核酸內(nèi)切酶表達(dá)載體，適用于任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

當(dāng)前基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，CRISPR/Cas9 技術(shù)以其優(yōu)勢(shì)必將迅速推動(dòng)基因組功能的研究。快速獲取目標(biāo)gRNA 并檢測(cè)驗(yàn)證其活性將會(huì)推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。本文旨在建立一種體外gRNA 快速合成及檢測(cè)的方法，這一方法的建立將減少利用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因編輯的時(shí)間，快速實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。

1 材料和方法

1.1 材料

8 周齡SPF 級(jí)C57 小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】，PCR儀(Bio-Rad T100TM Thermal Cycler)、Tanon 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)、NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo)、T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)、RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMKit，Ambion)、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit)、無核酸酶水、dNTP mixture、高保真酶Taq 酶(Sigma)、Cas9 核酸酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)

1.2 gRNA 靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈合成

利用http://crispr．mit．edu/ 設(shè)計(jì)能夠結(jié)合NKp46 外顯子Exon3 上的gRNA(20nt)。引物及gRNA 通用模板由Invitrogen 公司合成。

1.3 gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的PCR 擴(kuò)增

利用NKp46 gRNA 特異的上游引物mNKp46_g1F 和gRNA 通用下游引物gRNA-R，以人工合成的gRNA 通用模板DNA 片段為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到NKp46 基因特異的gRNA 轉(zhuǎn)錄模板。具體反應(yīng)條件如下:(94℃30s，60℃10s，72℃30 s)×35，72℃10 min，4℃保存。取5 μL 電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，確定得到目標(biāo)DNA 片段，大小為123 bp。

1.4 gRNA 模板的體外轉(zhuǎn)錄

在得到gRNA 轉(zhuǎn)錄模板后利用純化試劑盒進(jìn)行g(shù)RNA 轉(zhuǎn)錄模板的純化。將純化后的產(chǎn)物用T7 RNAkit 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)進(jìn)行NKp46 gRNA 體外轉(zhuǎn)錄并利用RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMkit，Ambion)將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。合成的gRNA 通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)檢測(cè)濃度及純度。分裝并－80℃凍存。

1.5 gRNA 體外活性及特異性檢測(cè)

將得到的gRNA 與Cas9 核酸酶以及目的DNA混合孵育，電泳后觀察條帶大小并觀察片段灰度來確定切割效率。反應(yīng)體系:dsDNA(4μL)，gRNA(體外轉(zhuǎn)錄)(1μL)，Cas9 核酸酶(1μL)，10 × buffer(2μL)，ddH2O(12μL)，反應(yīng)總體系(20μL)按照上述反應(yīng)體系，混合好反應(yīng)溶液，37℃30 min，65℃5 min。

2 結(jié)果

2.1 小鼠NKP46 基因gRNA 靶點(diǎn)選擇

NKp46 基因存在于嚙齒類動(dòng)物(大鼠和小鼠)和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如黑猩猩和短尾猿中。同時(shí)NKp46是唯一能被小鼠細(xì)胞上表達(dá)配體所識(shí)別的人類NK細(xì)胞激活受體。為了研究NKP46 基因在病毒感染過程中的作用，我們希望通過Cas9 技術(shù)創(chuàng)建NKP46敲除小鼠。利用網(wǎng)站http://crispr．mit．edu/，設(shè)計(jì)得到gRNA，見表1。

表1 gRNA 靶點(diǎn)序列Tab．1 The CRISPR target sequences

本文以小鼠NKP46 基因?yàn)槔O(shè)計(jì)gRNA。共選擇了2 條gRNA 序列:

gRNA1 GGTGAACATCTGGTGTCAGG，gRNA2 CTCGGTGAACATCTGGTGTC 這兩個(gè)gRNA位于Nkp49 基因組上外顯子Exon3 處。

2.2 NKp46gRNA 體外擴(kuò)增模板的設(shè)計(jì)

gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的結(jié)構(gòu):T7 啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(20nt)、保守序列。體外擴(kuò)增模板序列是固定的即gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的保守序列GTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT，該片段可以形成gRNA 的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，是所有g(shù)RNA 都包括的一部分。

2.3 上游引物gRNA-F 的設(shè)計(jì)

將得到的20nt 的序列前端加上一段T7 啟動(dòng)子序列TAATACGACTCACTATAGGG 并在末尾加上與gRNA 固有序列前端相同的幾個(gè)堿基 GTTTTAGAGCTAG，最終設(shè)計(jì)得到一個(gè)53nt 的片段。按照該方法設(shè)計(jì)并合成了靶向小鼠NKP46 基因的mNKp46_g1F。mNKp46_g1F 將作為轉(zhuǎn)錄模板合成過程中的上游引物，參與PCR 反應(yīng)。由于體外轉(zhuǎn)錄試劑盒在轉(zhuǎn)錄完成后會(huì)在5’端多出3 個(gè)G 所以在設(shè)計(jì)選擇靶向gRNA 時(shí)可以選擇起始位置帶G 的序列，這樣可以最大限度的減少體外轉(zhuǎn)錄的影響，它的構(gòu)成(圖1)mNKp46 _ g1F TAATACGACTCACTA TAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAG

圖1 上游引物結(jié)構(gòu)示意圖Fig．1 Schematic diagram of the forward primer structure．The designed primer consists of three parts:T7 promoter，the target sequence (20nt)，and 13 bp gRNA conserved sequence

2.4 gRNA 合成的通用下游引物

gRNA-R 的設(shè)計(jì)AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC，該序列與gRNA 模板3’端互補(bǔ)。

2.5 靶向小鼠NKP46 基因的gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板在體外完成擴(kuò)增

該過程十分簡(jiǎn)單只需一步PCR 反應(yīng)就可以迅速得到足夠濃度的帶有T7 promoter 的gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板，參與反應(yīng)的上游引物已經(jīng)按照上述方法設(shè)計(jì)合成，其中下游引物和模板由于是通用的不具有特異性，不需要每次都合成。當(dāng)研究者更換目標(biāo)基因，只需設(shè)計(jì)合成一條新的上游引物即可，下游引物及模板不需要重復(fù)合成，十分的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)。擴(kuò)增過程(見圖2)。然后體外轉(zhuǎn)錄得到足夠濃度gRNA 的靶向NKP46 基因的gRNA。

2.6 體外利用Cas9 核酸酶檢測(cè)驗(yàn)證該方法確實(shí)可以得到高特異性及活性的gRNA

設(shè)計(jì)體外檢測(cè)引物mNk46_gSF TCCAAACAC GTGCATGTTACACATG，mNk46_gSR CCCAGCTTTG ACTCTCTTGTCCATC 以小鼠DNA 作為模板，利用該引物可以擴(kuò)增NKP46 基因，作為體外酶切檢測(cè)的片段。該片段中包含gRNA 的靶點(diǎn)，利用這種體外檢測(cè)方法，可以迅速對(duì)設(shè)計(jì)合成的gRNA 的特異性及活性進(jìn)行檢測(cè)，通過電泳可以觀察剪切條帶的大小，以驗(yàn)證靶點(diǎn)位置是否正確，進(jìn)一步可以通過T-A 克隆檢測(cè)切開位置。本文設(shè)計(jì)的靶向NKP46 的gRNA在靶點(diǎn)位置切開，使得全長(zhǎng)1297 bp 檢測(cè)條帶，被切成兩條帶，大小分別為804 bp 和493 bp(圖3A)。通過對(duì)灰度的計(jì)算(圖3B)，計(jì)算得到轉(zhuǎn)錄后原濃度的gRNA 以及稀釋一倍的gRNA，剪切效率都為100%，由此可以證明該方法設(shè)計(jì)合成gRNA 特異性及活性較高，同時(shí)體外檢測(cè)快速檢測(cè)的方法大大提高了gRNA 檢測(cè)的效率。

圖2 gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄示意圖Fig．2 A schematic diagram of the gRNA template structure and transcription

3 討論

常規(guī)獲取gRNA 要構(gòu)建表達(dá)載體，需要把gRNA的轉(zhuǎn)錄模板連接到載體上，經(jīng)過涂板挑選單克隆再搖菌后提取質(zhì)粒，最后還要酶切使質(zhì)粒線性化才能得到gRNA 的體外轉(zhuǎn)錄模板，得到gRNA 最少也需要3d 的時(shí)間。而本文建立的這種方法將極大地節(jié)約轉(zhuǎn)錄gRNA 的時(shí)間，一步PCR 反應(yīng)就可以得到足夠濃度的轉(zhuǎn)錄模板，僅需半天時(shí)間就可以得到需要的gRNA。本文建立的這種活性及特異性檢測(cè)方法，可以在體外迅速驗(yàn)證gRNA 的其活性及特異性。將Cas9 核酸酶、gRNA、PCR 擴(kuò)增的靶基因片段混合孵育，通過瓊脂糖凝膠電泳可以十分清楚的觀察到剪切位置并通過對(duì)電泳照片的灰度比較可以進(jìn)一步計(jì)算剪切效率。

建立的這種快速利用CRISPR /Cas 9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因編輯的方法，最具特色的是gRNA 的獲得及體外酶切檢測(cè)。與常規(guī)方法相比我們不構(gòu)建gRNA 表達(dá)載體而是直接利用化學(xué)合成方法。在體外合成一段單鏈DNA，通過設(shè)計(jì)引物，利用PCR 技術(shù)迅速擴(kuò)增該片段，并轉(zhuǎn)錄純化得到有功能的gRNA。利用這種gRNA 快速合成及檢測(cè)的方法，可以使每次基因編輯僅需合成一段與目的基因互補(bǔ)的一小段DNA 鏈即一個(gè)上游引物即可，模板和下游引物都是通用的方便而經(jīng)濟(jì)。本文建立的體外酶切檢測(cè)方法可以在得到gRNA 后迅速對(duì)其活性及特異性檢測(cè)，為后續(xù)轉(zhuǎn)染或顯微注射篩選有效的gRNA 節(jié)省了寶貴的時(shí)間。

圖3 體外檢測(cè)片段擴(kuò)增及酶切位點(diǎn)示意圖Fig．3 A schematic diagram of the amplification and detection of fragments cleavage sites in vitro

［1］Smithies O，Gregg R G，Boggs SS，et al．Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination［J］．Nature．1985，317(6034):230 －234．

［2］Weterings E，Chen DJ．The endless tale of non-homologous endjoining［J］．Cell Res．2008，18(1):114 －124．

［3］Mahfouz MM，Li L，Shamimuzzaman M，et al．De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks［J］．Proc Natl Acad Sci U S A．2011，108(6):2623 －2628．

［4］Mali P，Yang L，Esvelt KM，et al．RNA-guided human genome engineering via Cas9［J］．Science．2013，339(6121):823 －826．

［5］Chang N，Sun C，Gao L，et al．Genome editing with RNAguided Cas9 nuclease in zebrafish embryos［J］．Cell Res．2013，23(4):465 －472．

［6］Shen B，Zhang J，Wu H，et al．Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting ［J］．Cell Res．2013，23(5):720 －723．

［7］Wang H，Yang H，Shivalila CS，et al．One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］．Cell．2013，153(4):910 －918．

［8］Li D，Qiu Z，Shao Y，et al．Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system［J］．Nat Biotechnol．2013，31(8):681 －683．

［9］Shan Q，Wang Y，Li J，et al．Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system［J］．Nat Biotechnol．2013，31(8):686 －688．

［10］Feng Z，Zhang B，Ding W，et al．Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system［J］．Cell Res．2013，23(10):1229 －1232．

［11］Jiang W，Bikard D，Cox D，et al．RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems［J］．Nat Biotechnol．2013，31(3):233 －239．

［12］Li W，Teng F，Li T，et al．Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPRCas systems［J］．Nat Biotechnol．2013，31(8):684 －686．

［13］Wang H，Yang H，Shivalila CS，et al．One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］．Cell．2013，153(4):910 －918．

［14］Cong L，Ran F A，Cox D，et al．Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］．Science．2013，339(6121):819 －823．

［15］Ding Q，Regan S N，Xia Y，et al．Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs［J］．Cell Stem Cell．2013，12(4):393 －394．