新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶類化合物的合成及其抗腫瘤活性*

王　京，林　婭，朱心玲，聶　晶，張　磊，姚其正(．遵義醫學院藥學院，貴州遵義　563003; ．中國藥科大學藥學院，江蘇南京　0009)

新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶類化合物的合成及其抗腫瘤活性*

王京1，林婭1，朱心玲1，聶晶1，張磊1，姚其正2
(1．遵義醫學院藥學院，貴州遵義563003; 2．中國藥科大學藥學院，江蘇南京210009)

摘要:以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮為原料，經Vilsmeier－Haack反應和Biginelli反應制得4-(5-氯-3-甲基-1-苯基-唑-4-基) -5-甲酸乙酯-6-甲基-3，4-二氫嘧啶-2(1H) -硫酮(3) ; 3與芳醛經Knoevenagel反應合成了5個新型的含吡唑的噻唑［3，2-a］并嘧啶類化合物(5a～5e)，其結構經1H NMR，13C NMR，IR和ESI-MS表征。采用MTT法測定了5a～5e的抗腫瘤活性。結果表明: 5a～5e對人前列腺癌PC-3細胞均具有一定的體外抗增殖活性，其中2-【4-{［6-(乙氧羰酯) -5-(5-氯-3-甲基-1-苯基-吡唑-4-基) -3-氧代-7-甲基-噻唑并［3，2-a］嘧啶-2(5H) -亞基］甲基}苯氧基】乙酸(5a)活性最強，其IC50為44．45 μM。

關鍵詞:噻唑并［3，2-a］嘧啶;吡唑;合成;抗腫瘤活性

噻唑并［3，2-a］嘧啶是一類具有多種生物活性的母核結構，如抗病毒［1］、抗腫瘤［2］、抗炎［3］和抗菌［4］等，同時還能抑制Bcl-2家族抗凋亡亞族蛋白［5］及CDC25B磷酸酯酶［6］。吡唑作為一類結構特殊的氮雜環，也具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗菌和抗炎等。近年來，上述兩類化合物受到了人們廣泛的關注和研究。因此，將具有抗腫瘤活性的噻唑并［3，2-a］嘧啶結構和吡唑結構融合到一個新型分子中，對篩選具有抗腫瘤活性的先導化合物具有重要的意義。

為此，本文以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(1)為原料，經Vilsmeier－Haack反應和Biginelli反應制得4-(5-氯-3-甲基-1-苯基-唑-4-基) -5-甲酸乙酯-6-甲基-3，4-二氫嘧啶-2 (1H) -硫酮(3) ; 3與芳醛(4a～4e)經Knoevenagel反應合成了5個新型含吡唑的噻唑［3，2-a］并嘧啶類化合物(5a～5e，Scheme 1)，其結構經1H NMR，13C NMR，IR和ESI-MS表征。采用MTT法測定了5a～5e對人前列腺癌PC-3細胞的體外抗腫瘤活性。

Scheme 1

1　實驗部分

1．1儀器與試劑

Mel-TEMP型熔點儀(溫度未校正) ; Bruke Avance 300 MHz型和Agilent-NMR-vnmrs 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標) ; Nicolet Impact 410型紅外光譜儀(KBr壓片) ; Agilent 1100 LC/DAD/ MSD型質譜儀。

5-氯-3-甲基-1-苯基-4-吡唑甲醛(2)［10］和3［11］參考文獻方法合成;薄層層析板和硅膠，青島海洋化工廠;其余所用試劑均為分析純。

1．2 5a～5e的合成(以5a為例)

在反應瓶中加入混合溶劑［V(醋酸)∶V(醋酸酐) = 4∶3］7 mL，攪拌下依次加入3 0．78 g(2 mmol)，2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸(4a) 0．36 g(2 mmol)，氯乙酸0．20 g(2．2 mmol)和乙酸鈉0．16 g (2 mmol)，回流反應6 h(TLC檢測)。冷卻至室溫，傾入冰水混合物中，攪拌析晶;抽濾，濾餅用水(3×5 mL)洗滌，干燥后用甲醇重結晶得黃色固體2-【4-{［6-(乙氧羰酯) -5-(5-氯-3-甲基-1-苯基-吡唑-4-基) -3-氧代-7-甲基-噻唑并［3，2-a］嘧啶-2 (5H) -亞基］甲基}苯氧基】乙酸(5a)。

用類似的方法合成黃色固體5b～5e。

5a:收率79%，m．p．152℃～154℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．13(m，2H，CH2in Et)，4．91(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．10 (d，J = 8．5 Hz，2H，ArH)，7．44～7．58(m，7H，ArH)，7．79(s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．74，14．50，22．89，46．93，60．64，65．07，105．58，116．00，117．00，117．19，117．52，125．25，126．22，126．48，126．61，128．85，129．67，132．52，133．21，137．89，148．94，152．12，155．87，159．91，160．18，164．89，165．41，169．24，170．18; IR ν: 3 746，3 604，3 392，3 191，2 979，2 931，1 770，1 714，1 593，1 552，1 502，1 413，1 363，1 322，1 216，1 148，1124，1074，998 cm－1; ESI-MS m/z: 591．3{［M－H］－}。

5b:收率62%，m．p．143℃～146℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，3．83(s，3H，OCH3)，4．06～4．17(m，2H，CH2in Et)，4．78(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．01(d，J =8．4 Hz，1H，ArH)，7．15～7．20 (m，2H，ArH)，7．42～7．54(m，5H，ArH)，7．78(s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．71，14．47，22．89，46．90，56．07，60．63，65．31，105．51，113．69，114．00，117．21，117．53，124．03，125．21，126．57，128．81，129．64，133．63，137．90，148．96，149．48，149．91，152．18，155．84，164．80，165．37，170．13; IR ν: 3 634，3 185，2 979，2 932，2 713，2 330，1 707，1 619，1 593，1 555，1 512，1 422，1 368，1 327，1 396，1 277，1 231，1 158，1121，1057 cm－1; ESIMS m/z: 623．1{［M +H］+}。

5c:收率67%，m．p．198℃～200℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，1．36(t，J =6．9 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．17(m，4H，CH2in Et)，4．91(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．02(t，J =8．5 Hz，1H，ArH)，7．13～7．21 (m，2H，ArH)，7．41～7．54(m，5H，ArH)，7．77 (s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．73，14．48，15．02，22．79，46．88，52．35，60．66，64．41，65．30，105．49，114．03，114．95，117．23，117．46，123．95，125．24，126．59，126．75，128．85，129．67，133．73，137．85，148．64，148．93，149．77，151．99，156．00，164．77，165．34，169．33，170．22; IR ν: 3 480，2 979，2 914，2 855，2 377，1 761，1 731，1 708，1 661，1 590，1 552，1 502，1 419，1 369，1 307，1 281，1 162，1 142，1 121，1 065，1 001 cm－1; ESI-MS m/z: 635．1{［M－H］－}。

5d:收率70%，m．p．205℃～207℃;1H NMR δ: 1．21(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．23(s，3H，CH3)，2．43(s，3H，CH3)，4．12～4．23(m，2H，CH2in Et)，4．80(s，2H，a-H)，6．15(s，1H，CH)，7．10～7．27(m，3H，ArH)，7．49～7．60(m，6H，ArH)，7．87(s，1H，CH = ) ;13C NMR δ: 12．74，14．50，22．86，46．97，60．70，64．94，105．83，115．90，117．31，117．58，120．48，123．03，125．27，126．65，128．87，129．67，130．98，133．12，134．64，137．85，148．93，151．92，155．59，158．61，164．68，165．37，170．43; IR ν: 3 474，3 415，3 191，2 949，2 525，2 289，1 746，1 708，1 609，1 540，1 499，1 372，1 326，1 303，1 261，1 222，1 161，1 074 cm－1; ESI-MS m/z: 591．0{［M－H］－}。

5e:收率72%，m．p．165℃～167℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．30(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．17(m，2H，CH2in Et)，4．98(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．08～7．18(m，2H，ArH)，7．44～7．54(m，7H，ArH)，8．06(s，1H，CH = ) ;13C NMR δ: 12．74，14．47，22．64，46．96，52．41，60．70，65．32，105．66，113．41，117．27，120．15，122．07，122．29，125．23，126．65，128．11，128．82，129．26，129．64，133．04，137．85，148．95，151．61，156．18，156．87，164．80，165．29，169．23; IR ν: 3 463，3 168，2 985，2 920，2 855，2 330，2 123，1 935，1 742，1 704，1 591，1 548，1 499，1 448，1 360，1 309，1 277，1 227，1 161，1 048 cm－1; ESI-MS m/z: 591．4{［M－H］－}。

1．3體外抗腫瘤活性測試

以5-氟脲嘧啶(5-FU)為陽性對照，采用四氮唑鹽還原法(MTT法)測定5a～5e對人前列腺癌PC-3細胞(簡稱PC-3)的體外抗腫瘤活性。

將處于指數生長期的細胞配成c為3．5×104個·mL－1的細胞懸液，在96孔細胞培養板中每孔加入100 μL細胞懸液(每孔3．5×103個細胞)，將細胞培養板置于37℃，5% CO2培養箱中培養24 h。用完全培養基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μL相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組，陽性對照組，96孔細胞培養板置于37℃，5%CO2培養箱中培養72 h。每孔加入20 μL MTT(5 mg· mL－1)，在培養箱繼續培養4 h。棄去培養基，每孔加入150 μL DMSO溶解，混勻10 min，于酶標儀讀出每孔的OD值(λ=490 nm)，計算抑制率，再由統計軟件SPSS17．0計算出半數抑制濃度(IC50)值。

2　結果與討論

2．1抗腫瘤活性

5a～5e的體外抗增殖活性結果見表1。由表1所示，5a～5e對PC-3均具有一定的體外抗腫瘤活性，其中5a的活性最強，其IC50值為44．45 μM，與5-FU(38．47 μM)相當; 5c和5e對PC-3沒有顯示出抑制腫瘤細胞增殖的作用，其IC50值均大于100 μM。

在倒置相差顯微鏡下進一步觀察不同c(5a)作用于PC-3細胞72 h后其細胞數量及形態的變化，結果見圖1。

圖1　　c(5a)對PC-3細胞形態的影響(作用時間72 h)Figure 1 　Effect of c(5a) on morphology of PC-3 cells for 72 h

表1　　5a～5e對人前列腺癌PC-3細胞的體外抗增殖活性Table 1 　Anticancer activities of 5a～5e against PC-3 cells in vitro

由圖1可見，陰性對照組細胞數量較多，其輪廓清晰且活力旺盛;而實驗組細胞數量隨著c(5a)增大而顯著減少，且細胞皺縮、變形和染色質濃縮。

2．2構效關系

初步構效關系研究表明:結構末端的氧代乙酸片段處于苯環對位(5a)時，化合物的抗腫瘤活性較強;處于間位(5d)的次之，處于鄰位(5e)沒有活性;當氧代乙酸片段處于苯環對位，而相鄰位置有取代基時，化合物的活性減低，并且取代基越大，活性越低，如5b和5c。

3　結論

利用藥效團骨架拼合等原理，設計并合成了5個新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶類化合物(5a～5e)。同時采用MTT法測試了其對人前列腺癌PC-3細胞的細胞毒性。結果表明: 5a～5e均具有一定的抗腫瘤細胞增殖活性，其中5a的抗腫瘤活性最強，與陽性對照5-FU藥效相當，具有進一步深入研究的價值。

參考文獻

［1］Mohamed S F，Flefel E M，Amr A E G E，et al．Anti-HSV-1 activity and mechanism of action of some new synthesized substituted pyrimidine，thiopyrimidine and thiazolopyrimidine derivatives［J］．Eur J Med Chem，2010，45(4) :1494－1501．

［2］Holla B S，Rao B S，Sarojini B K，et al．One pot synthesis of thiazolodihydropyrimidinones and evaluation of their anticancer activity［J］．Eur J Med Chem，2004，39 (9) :777－783．

［3］Hu J，Wang Y，Wei X，et al．Synthesis and biological evaluation of novel thiazolidinone derivatives as potential anti-inflammatory agents［J］．Eur J Med Chem，2013，64:292－301．

［4］Pan B，Huang R，Zheng L，et al．Thiazolidione derivatives as novel antibiofilm agents: Design，synthesis，biological evaluation，and structure-activity relationships ［J］．Eur J Med Chem，2011，46(3) :819－824．

［5］Zhou B，Li X，Li Y，et al．Discovery and development of thiazolo［3，2-a］pyrimidinone derivatives as general inhibitors of Bcl-2 family proteins［J］．Chem Med Chem，2011，6(5) :904－921．

［6］Kolb S，Mondésert O，Goddard M L，et al．Development of novel thiazolopyrimidines as CDC25B phosphatase inhibitors［J］．Chem Med Chem，2009，4(4) :633－648．

［7］Vujasinovic I，Paravic-Radi?evic A，Mlinaric-Majerski K，et al．Synthesis and biological validation of novel pyrazole derivatives with anticancer activity guided by 3D-QSAR analysis［J］．Bioorg Med Chem，2012，6(20) : 2101－2110．

［8］Xu L L，Zheng C J，Sun L P，et al．Synthesis of novel 1，3-diaryl pyrazole derivatives bearing rhodanine-3-fatty acid moieties as potential antibacterial agents［J］．Eur J Med Chem，2012，48:174－178．

［9］Chavan H V，Bandgar B P，Adsul L K，et al．Design，synthesis，characterization and anti-inflammatory evaluation of novel pyrazole amalgamated flavones［J］．Bioorg Med Chem Lett，2013，23(5) :1315－1321．

［10］杜海堂，杜海軍，歐陽貴平．N-(取代對三氟甲基苯基) -N'-(1，3，5-三取代吡唑-4-羰基)硫脲的合成與生物活性［J］．有機化學，2008，28(2) :356－360．

［11］Solanki M J，Shah V H．Synthesis，antibacterial，and antifungal activities of some novel derivatives of thiazolo［2，3-b］dihydropyrimidine possessing 4-pyrazolyl moiety［J］．Asian J Chem，2012，24(7) :2972－2974．

·研究論文·

Synthesis and Anticancer Activities of Novel Thiazolo［3，2-a］pyrimidine Derivatives Containing Pyrazole Group

WANG Jing1，LIN Ya1，ZHU Xin-ling1，NIE Jing1，ZHANG Lei1，YAO Qi-zheng2
(1．School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China; 2．School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:4-(5-Chloro-3-methyl-1-phenyl-4-pyrazolyl) -3，4-dihydronpyrimidin-2 (1H) -(thio) one (3) was prepared by Vilsmeier－Haack and Biginelli reaction using 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one as the raw materials．Five novel thiazolo［3，2-a］pyrimidine derivatives containing pyrazole group (5a～5e) were synthesized by Knoevenagel reactions of 3 with arylaldehyde．The structures were characterized by1H NMR，13C NMR，IR and ESI-MS．The preliminary in vitro anticancer activities of 5a～5e against human prostate cancer PC-3 cells were tested by MTT assay．The results showed that 5a～5e exhibited certain anticancer activities and 2-【4-{［6-(ethoxycarbonyl) -5-(5-chloro-3-methyl-1-phenyl-4-pyrazolyl) -3-oxo-7-methyl-thiazolo［3，2-a］pyrimidin-2 (5H)-ylidene］methyl} phenoxy】acetic acid(5a) exhibited the strongest anticancer activities with IC50of 44．45 μM．

Keywords:thiazolo［3，2-a］pyrimidine; pyrazole; synthesis; anticancer activity

作者簡介:王京(1988－)，女，漢族，貴州遵義人，碩士，主要從事抗腫瘤新藥分子的設計與合成研究。E-mail: wangjing@ zmc．edu．cn

基金項目:貴州省科技廳項目{黔科合LH字［2014］7565號，黔科合LH字［2014］7557號，黔科合人才團隊［2014］4002號} ;貴州省教育廳項目{黔科合人才團隊字［2012］03號} ;遵義醫學院博士科研啟動基金資助項目(F-631)

*收稿日期:2014-08-27;

修訂日期:2015-03-13

中圖分類號:O626．2; O621．3

文獻標識碼:A

DOI:10．15952/j．cnki．cjsc．1005－1511．2015．07．0580

通信聯系人:張磊，博士，Tel．0851-28609461，E-mail: lei_chang@ yeah．net