小兒啟脾片微生物限度檢查方法驗證研究

顏明王東興王艷美王寶慶

（1牡丹江市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管醫院；3牡丹江靈泰藥業股份有限公司）

小兒啟脾片微生物限度檢查方法驗證研究

顏明1王東興2王艷美3王寶慶1

（1牡丹江市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管醫院；3牡丹江靈泰藥業股份有限公司）

目的：驗證小兒啟脾片微生物限度檢查的方法。方法：采用《中國藥典》2010年版一部附錄ⅧC微生物限度檢查法，對小兒啟脾片進行微生物限度檢查。通過3次獨立的平行試驗,分別計算5種驗證菌每次試驗的回收率。采用在相同環境下培養和觀察大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌的方法來驗證控制菌。結果：5種驗證菌的回收率均高于70%；控制菌檢查中,試驗組均檢出驗證菌,陰性菌對照組均無生長。結論：可以采用常規方法檢查小兒啟脾片的微生物限度。

小兒啟脾片；微生物限度檢查；方法學驗證

小兒啟脾片是《國家食品藥品監督管理局國家藥品標準》所收載的品種，該藥品是由人參、山藥、山楂、茯苓、蓮子、白術、陳皮、澤瀉、麥芽、六神曲10味藥組成的復方制劑，主要用于治療脾胃虛弱，食欲不振，消化不良，腹脹便溏等。本組方中山楂、白術、陳皮和六神曲[1-5]均報道有抗菌或抑菌的作用，因此按照常法檢驗其微生物限度得到的結果不準確，根據《中國藥典》2010年版規定，必須采用方法學驗證試驗說明微生物限度檢查法結果準確性和試驗方法的可靠性[6]。本研究對小兒啟脾片微生物限度檢查方法驗證研究報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

BSC-1100ⅡB2生物安全柜；PL202-L電子天平；PL202-L架盤藥物天平；LDEX-40Ⅱ立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋；360-HHB-420BS恒溫培養箱；HPS-280生化培養箱；CJ-C-DⅡ層流潔凈工作臺；SY101-S-Z電熱鼓風干燥箱；LDE4-1.2離心機；HHS11-2-Ⅱ電熱恒溫水浴器。

1.2 培養基

營養瓊脂培養基（批號：130228）；玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：130111）；營養肉湯培養基 （批號：130922）；膽鹽乳糖培養基（批號：131012）；曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB）（批號：130111）；改良馬丁培養基（批號：130110）；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG）（批號：130117），均由北京叁藥科技開發公司生產，中國食品藥品檢定研究院監制。

1.3 樣品

小兒啟脾片（牡丹江靈泰藥業股份有限公司提供，批號：140102，140103，140104）。

1.4 驗證菌種

枯草桿菌CMCC（B）63501，金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，大腸埃希菌 CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中國食品藥品檢定研究院提供，本試驗所使用的菌株均為第3代。

2 方法和結果

2.1 菌液制備

參照《中國藥典》2010年版一部附錄[6]方法，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物到營養肉湯培養基中，經33～35℃培養18～ 35小時，接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，經23～28℃培養18～24小時后，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋法依次稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至 10-7、大腸埃希菌稀釋至10-7、枯草芽孢桿菌稀釋至10-6，白色念珠菌稀釋至10-6，制成約為50～100 cfu/m L的菌懸液，做活菌計數備用；接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，經25℃培養7天，用5 m L含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，吸取此溶液1 m L，用含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋法稀釋至10-5，約為50～ 100 cfu/m L，做活菌計數備用，本試驗所使用的菌液均為第1代。

2.2 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑制備

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑按照《中國藥典》2010年版一部附錄[7]方法制備。

2.3 供試液制備

取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑100 m L，混勻，取約10 m L離心5分鐘，500轉/分鐘，取上清液做為1∶10的供試液。

2.4 細菌、霉菌及酵母菌數計數方法驗證（平皿法）

2.4.1 試驗組取1∶10的供試液1 m L與上述制備好的陽性對照菌液1 m L置于平皿中，立即加入15～20m L相應培養基，待凝固后置規定條件下培養，測定所加的試驗菌數，每株菌制備 10個平皿，逐日觀察結果，計數。

2.4.2 菌液組取上述各菌液1 m L分別加入平皿中，立即加入15～ 20 m L相應培養基，待凝固后置規定條件下培養，逐日觀察結果，測定每一菌株所加的試驗菌數，每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.4.3 供試品對照組除不加菌液外，方法同試驗組，測定供試品本底菌數。每株菌制備10個平皿。

2.4.4 稀釋劑對照組取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑1 m L代替供試液，方法同試驗組，測定所加的試驗菌數，每株菌制備10個平皿。

2.4.5 計算

試驗組的菌數回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數 × 100%。

2.4.6 試驗結果見表1。

2.5 控制菌檢查方法驗證

2.5.1 大腸埃希菌和大腸菌群菌種：陽性對照菌——大腸埃希菌 （44102）；陰性對照菌——金黃色葡萄球菌（26003）。

2.5.2 試驗組取1∶10的供試品10 m L加入膽鹽乳糖培養基100 m L中，加入陽性對照菌大腸埃希菌菌液1 m L，搖勻，置35～ 37℃培養18～24小時，按相應的控制菌檢查法檢查。大腸埃希菌濃度同細菌、霉菌及酵母菌計數驗證。

2.5.3 陰性對照組方法同試驗組，取100 m L膽

鹽乳糖培養基，加入1 m L陰性對照菌金黃色葡萄球菌，置35～ 37℃培養18～ 24小時，按相應的控制菌檢查法檢查。金黃色葡萄球菌濃度同細菌、霉菌及酵母菌計數驗證。

2.5.4 試驗結果見表2。

表1 細菌、霉菌及酵母菌數計數驗證結果

表2 控制菌檢查結果

3 討論

小兒啟脾片是含有多種有效成分的中藥復方制劑，其中任何成分具有抑菌作用都可能影響微生物限度檢查的準確性，因此本文以《中國藥典》2010年版一部微生物限度檢查法為依據，采用5種陽性對照菌的回收率試驗作為評價標準，確定了小兒啟脾片微生物限度檢查的方法。

由表1試驗數據可知，試驗組的回收率大于70%，平行3次試驗結果均符合規定，結果表明可以采用常規法以1∶10的溶液作為供試品溶液進行細菌、霉菌及酵母菌計數的檢查；由表2可知，陰性對照組未檢出大腸埃希菌和大腸菌群，試驗組檢出了大腸埃希菌和大腸菌群，結果表明可以采用常規法進行本品的控制菌大腸埃希菌和大腸菌群的檢查。綜上所述，常規法用于小兒啟脾片的微生物限度檢查，結果可靠。

[1] 李建華，胡金林.山楂的藥理作用與臨床應用[J].中國藥物濫用防治雜志，2011，17（6）：334-336.

[2] 吳士杰，李秋津，肖學鳳，等.山楂化學成分及藥理作用的研究[J].藥物評價研究，2010，33（4）：316-319.

[3] 宿廷敏，王敏娟，阮時寶.白術的化學成分及藥理作用研究概述[J].貴陽學院學報（自然科學版），2008，3（2）：32-35.

[4] 李偉偉，張國偉.陳皮黃酮類成分研究進展[J].中國醫學創新，2014，11（24）：154-156.

[5] 王秋紅，付新，王長福，等.六神曲的抗菌活性研究[D].中華中醫藥學會中藥炮制分會2009年學術研討會論文集，2009.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅧC，79-88.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅧH，104.

Research on M ethod Validation of M icrobial Lim it Test for Pediatric Qipi Tablets

Yan M ing1，Wang Dongxing2，Wang Yanmei3，Wang Baoqing1（1 Food and Drug Inspection Testing Center of Mudanjiang City,Heilongjiang Mudanjiang 157011,China；2 Mudanjiang Cardiovascular Hospital;3 Mudanjiang Lingtai Pharmaceutical Co.,LTD.）

Objective:To validate the method of m icrobial limit test for pediatric qipi tablets.M ethods:The method of microbial limit test set forth in the appendixⅧ C of the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition was adopted to determine the microbial limit of pediatric qipi tablets.Through three independent parallel tests,the recovery of each test using five kinds of bacteria for validation was calculated respectively.In order to verify the control bacteria,E.coli and Staphylococcus aureus were cultured and observed at the same environment.Results:The recovery of five kinds of bacteria was all higher than 70%,and bacteria for validation were detected in the test group,but no grow th was observed in the negative control group.Conclusion:The conventional method can be used for the m icrobial limit test of pediatric qipi tablets.

Pediatric Qipi Tablets；M icrobial Lim it Test；Methodology Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.05.005

2015-01-30）

顏明，女，副主任藥師。研究方向：藥品監督檢驗與藥品不良反應監測。E-mail：88934182@qq.com