一株僅產L-乳酸的乳酸乳球菌發酵培養基的優化

周 穎，高曉峰，周 晶，霍貴成*

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳酸（2-羥基丙酸）是一種天然有機酸，由于其在食品、化妝品、醫藥及化工產業有重要的應用而得到廣泛關注[1]。與消旋的DL-乳酸相比，高光學純度的乳酸同分異構體（L-乳酸和D-乳酸）具有更高的工業價值[2]。由于人和動物體內只有代謝L-乳酸的酶，攝入過量D-乳酸會引起代謝紊亂甚至酸中毒[3]。與此同時，工業生產的乳酸70%用于食品行業，主要用于酸奶和奶酪的生產以及食品防腐[4]。綜上所述，光學純度較高的L-乳酸具有更廣闊的應用前景。

全世界絕大部分乳酸的生產是通過發酵合成的[2]。乳酸生物合成的關鍵是同型發酵細菌，它們通常產生L-乳酸和D-乳酸的混合物[5]。而本實驗研究的乳酸乳球菌KLDS 4.0325屬于同型發酵，僅分泌L-乳酸且產量較高，因此具有相當的工業化生產L-乳酸的潛力[6]。

乳酸乳球菌KLDS 4.0325是由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的一株乳酸乳球菌，經相關基因（GenBank登錄號：552063405）分析研究顯示，該菌種中只含有編碼L-乳酸脫氫酶的基因序列，而不含有編碼D-乳酸脫氫酶的基因序列。目前，關于乳酸乳球菌生產乳酸的研究較少，而關于只產L-乳酸的乳酸乳球菌的研究更少。本研究希望驗證該菌種能夠僅合成L-乳酸而不合成D-乳酸，并通過響應面法優化L-乳酸發酵培養基，從而為工業化生產提供一株可供選擇的僅產L-乳酸的優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

乳酸乳球菌KLDS 4.0325由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室乳品工業微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）提供。

1.1.2 試劑

L-乳酸標準樣品 美國Sigma公司；L-/D-乳酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；酵母粉 英國Oxoid公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術公司。

1.1.3 培養基

種子培養基（M17培養基）：大豆蛋白胨5.0 g、蛋白胨2.5 g、酪蛋白胨2.5 g、酵母浸粉2.5 g、牛肉粉5.0 g、乳糖5.0 g、抗壞血酸鈉0.5 g、β-甘油磷酸鈉19.0 g、MgSO40.25 g，充分溶解后用蒸餾水定容至1 L。121℃滅菌15 min（固體培養基在此基礎上加瓊脂15 g）。

基礎發酵培養基：蛋白胨20 g、葡萄糖100 g、K2HPO410 g、MgSO40.5 g，充分溶解后定容至1 L，調節初始pH 7.0，115℃滅菌20 min；CaCO3于121℃單獨滅菌15 min，在無菌條件下加入到培養基中，添加量為60 g/L。

1.2 儀器與設備

HPX-87H色譜柱 美國Bio-Rad公司；Waters 2695 Separations Module HPLC System 美國Waters公司；HVE-50電熱蒸汽自動滅菌鍋 日本Hirayama公司；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多有限公司；ZHWY-100B恒溫培養振蕩器、SPX-150B生化培養箱 上海佳勝實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L-乳酸純度測定

利用L-/D-乳酸檢測試劑盒測定乳酸的光學純度。L-乳酸的光學純度按下式計算。

1.3.2 乳酸含量分析方法及乳酸標準曲線繪制

取5 mL發酵液，12 000 r/min離心10 min，除去菌體及多余的CaCO3。取上清液，加入質量分數72%的濃硫酸調節pH值為2.0左右。取100 μL稀釋10倍，以0.22 μm微孔濾器進行過濾即為待測液。

待測液采用Waters高效液相色譜儀分析：色譜柱為HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；檢測器為Waters2414示差檢測器，流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液；流動相流速為0.5 mL/min；柱溫65℃；進樣量為20 μL。

取250 mg乳酸標準品充分溶解，定容于25 mL容量瓶中，分別吸取2、4、6、8 mL定容于4個10 mL容量瓶中，制得質量濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/mL的乳酸標準溶液。標準曲線方程為Y=194 137X－4 177.3（R2=0.999 1）。

1.3.3 菌種移種時間的確定

將菌種活化后以2%的接種量接種于5 mL M17培養基中，30℃培養14 h，每隔1 h取樣一次測定OD600nm，用來表示菌體濃度，每組3個平行。

1.3.4 單因素試驗

所有發酵實驗的培養基初始pH值均為7.0，接種量為10%，發酵溫度為30℃，轉速為120 r/min，發酵時間為24 h。

以基礎發酵培養基為基礎，分別選擇100 g/L的麥芽糖、半乳糖、木糖、乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇、蔗糖作為唯一碳源進行試驗，從而確定最佳碳源。

在最佳碳源的基礎上，進一步考察20 g/L的不同氮源對L-乳酸產量的影響，確定最佳氮源。在最佳氮源的基礎上進行復合氮源優化試驗，共設計8個復配組，分別為1組：2 g/L酵母粉與18 g/L胰蛋白胨；2組：5 g/L酵母粉與15 g/L胰蛋白胨；3組：10 g/L酵母粉與10 g/L胰蛋白胨；4組：15 g/L酵母粉與5 g/L胰蛋白胨；5組：2 g/L酵母粉與18 g/L蛋白胨；6組：5 g/L酵母粉與15 g/L蛋白胨；7組：10 g/L酵母粉與10 g/L蛋白胨；8組：15 g/L酵母粉與5 g/L蛋白胨。考察不同氮源復配對L-乳酸產量的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗

根據上述單因素試驗結果，蔗糖和酵母粉以及蛋白胨被選出用于Plackett-Burman設計試驗，在參考了相關文獻[7-8]后，又選取了MgSO4質量濃度、K2HPO4質量濃度、NaCl質量濃度、CH3COONa質量濃度一同作為考察對象。通過Design Expert軟件進行Plackett-Burman設計（表1），以L-乳酸產量為響應值，通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對L-乳酸產量影響較顯著的因素。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平設計Table1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗及分析結果設計爬坡試驗，即對顯著因素進行質量濃度的梯度設計。在培養基的優化過程中，可以根據前期實驗擬合出的方程來確定各變量的最速上升路徑和變化步長，若系數為正，則該因素水平為遞增，反之遞減；以系數最大的變量為基準確定基本步長，以其他變量與基準變量系數的比值來確定其他變量的步長，確定了上升或下降方向及變化步長后便可以選取中心點進行試驗設計[9]。

1.3.7 響應面分析法優化培養基組分

根據以上試驗結果選取3個主要因素進行響應面分析法中的中心組合試驗設計，試驗因素及水平見表2。并用Design-Expert軟件對數據進行回歸分析。通過數據擬合相應模型，得到二次多項式，并最終確定最佳發酵培養基。

表2 中心組合試驗因素及水平設計Table2 Factors and levels used in central composite design

2 結果與分析

2.1 乳酸光學純度測定結果

通過試劑盒檢測，乳酸乳球菌KLDS 4.0325可產生光學純度100%的L-乳酸，這也是該菌株優于其他乳酸生產菌株的原因之一。Lactobacillus paracasei LA104生產L-乳酸的光學純度為97.3%[10]，Bacillus subtilis MUR1生產L-乳酸的光學純度為99.5%[11]。

2.2 菌種的移種時間

在乳酸發酵過程中選擇合適的移種時間至關重要，過老或年輕的種子都會對發酵產生不利影響[12]。一般來講，菌體處于對數生長中后期為移種的最佳時期。此時的種子繁殖能力強且菌體濃度高，接入發酵培養基后能很快進入對數生長期，有利于發酵的進行。由圖1可知，菌種的對數生長期為2～5 h，因此確定移種時間為5 h。

圖1 乳酸乳球菌KLDS 4.0325的生長曲線Fig.1 Cell growth curve of KLDS 4.0325

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 不同碳源對L-乳酸產量的影響

以基礎發酵培養基為基礎，碳源分別替換成不同的糖類，其他條件不變，比較不同碳源對L-乳酸產量的影響。由圖2可知，蔗糖作為碳源時L-乳酸產量最大為25.2 g/L，這也說明乳酸乳球菌KLDS 4.0325具有利用工業廢料糖蜜的潛質。而以乳糖和木糖作為碳源時，L-乳酸產量極少。

圖2 不同碳源對L-乳酸產量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on L-lactic acid content

2.3.2 不同氮源對L-乳酸產量的影響

在最佳碳源的基礎上，氮源分別替換成酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、乳清，其他條件不變，進行發酵培養。由圖3可知，酵母粉作為氮源時L-乳酸的產量明顯高于其他氮源，這可能與酵母粉中富含豐富的氨基酸、維生素等生長因子有關，這一結果與Kadam[13]、王玉華[14]、秦浩[15]、吳再強[16]等的研究結果一致。

圖3 不同氮源對L-乳酸產量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on L-lactic acid content

2.3.3 復合氮源優化結果

圖4 不同氮源組合對L-乳酸產量的影響Fig.4 Effect of mixed nitrogen sources on L-lactic acid content

雖然使用酵母粉單獨做氮源時L-乳酸產量最高，但是相對其他氮源來說，酵母粉價格昂貴，這將嚴重阻礙乳酸的大規模工業化生產[17]。為了減少成本，將酵母粉與兩種價格相對低廉的氮源混合發酵，保持總氮含量為20 g/L，由圖4可知，第5組，即2 g/L酵母粉與18 g/L蛋白胨的復配效果最好。這可能是由于酵母粉為菌株提供生長因子等微量營養物質，因此較少的酵母粉即可達到此目的。與其他乳酸菌[18-20]相比，乳酸乳球菌KLDS 4.0325對酵母粉的需求量相對較少。

2.4 Plackett-Burman試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，采用Plackett-Burman試驗，分析7個因素對L-乳酸產量的影響。試驗設計及結果見表3。當P=Prob＞F小于0.05時，該因素對L-乳酸產量有顯著影響，并且F值越大則表示該因素對L-乳酸產量影響越大。由表4可知，因素A、B、E對L-乳酸產量有顯著影響，且可信度在95%置信區間內，其中因素A（蔗糖添加量）對L-乳酸產量影響最大，其次為因素E（K2HPO4添加量）、因素B（酵母粉添加量），而其他因素對L-乳酸產量沒有顯著影響。選擇以上3個有顯著影響的因素進行最陡爬坡試驗，進行進一步優化。注：*.P＜0.05，表示差異顯著。表7同。

表3 Plackett-Burman試驗結果Table3 Results of Plackett-Burman experimental design

表4 Plackett-Burman試驗結果回歸分析Table4 Regression analysis of Plackett-Burman results

2.5 最陡爬坡試驗結果

表5 最陡爬坡試驗結果Table5 Results of steepest ascent design

根據Plackett-Burman試驗的結果，選擇合適的步長進行最陡爬坡試驗，為中心組合試驗提供合適的中心試驗點。由表5可知，第4組對應的L-乳酸產量最大。因此，選擇第4組作為中心組合試驗的中心點。

2.6 中心組合試驗設計及結果分析

以L-乳酸產量為響應值（設為Y），采用因素n=3，試驗次數N=20的中心組合設計進行優化試驗。各因素、水平及試驗結果見表6。通過對數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：

表6 響應面試驗設計方案及結果Table6 Response surface central composite design layout and experimental results

表7 回歸模型方差分析Table7 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

通過Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行分析，由表7可知，本實驗所選模型P=0.000 1＜0.05，說明方程擬合度較好；失擬項P=0.212 6＞0.05，說明失擬項不顯著；復相關系數R2=0.962 2，表明預測值和實測值相關性高；調整性決定系數R2Adj=0.928 1，R2Pre=0.784 3，二者之間相差較小，表明模型可信度高，能很好地描述實驗結果。

由表7可知，模型一次項A、E處于顯著水平，B項不顯著；交互項BE、AB、AE項均不顯著。

2.7 模型驗證及分析

對二次方程求導，當蔗糖、酵母粉、K2HPO4的添加量分別為102.9、2.5、7.9 g/L時，對應的L-乳酸產量最高為86.3 g/L。為了驗證方程的準確性，在上述條件下經行3次發酵實驗，測得L-乳酸產量分別為86.6、87.2、85.9 g/L，平均值為86.6 g/L，與方程預測值86.3 g/L的相對誤差為0.3%，說明該方程具有參考價值，能夠為生產提供一定的實踐依據。實驗結果表明，發酵培養基優化后的L-乳酸產量是基礎培養基的3.4倍，產酸速率可達3.61 g/（L?h）。相對于乳酸桿菌發酵產乳酸，乳酸乳球菌KLDS 4.0325具有僅產L-乳酸的特性，且產酸速率高于乳桿菌[13]。

目前為止，國內關于乳酸乳球菌生產乳酸的報道較少，國外有Lactococcus lactis IO-1[21]、L.lactis ATCC 19435[5]，L.lactis ssp.cremoris ASCC 930119[22]，L.lactis IFO 12007[23]等菌種生產L-乳酸的研究報道。Ramchandran等[22]研究了利用L.lactis ssp.cremoris ASCC 930119通過浸沒式發酵生產乳酸，產量可達60 g/L。L.lactis IO-1[24]搖瓶發酵乳酸產量為13.81 g/L，產酸速率為1.73 g/（L?h），與乳酸乳球菌KLDS 4.0325產酸量86.6 g/L、產酸速率3.61 g/（L?h）有較大的差距。Shi Zhouming等[5]研究了以菊芋粉為碳源，固定L.lactis ATCC 19435在纖維素膜反應器上進行分批補料發酵，產酸量可達142 g/L，產酸速率約為2.06 g/（L?h），該研究采用了先進的發酵技術，乳酸產量高于本實驗的菌株，而產酸速率卻低于乳酸乳球菌KLDS 4.0325。Ramchandran等[22]研究了L.lactis ssp.cremoris ASCC930119利用乳清粉發酵生產乳酸，最大產酸量可達60 g/L，明顯低于本實驗菌株。

3 結 論

本研究采用一株L-乳酸光學純度達100%的乳酸乳球菌KLDS 4.0325生產L-乳酸，并優化其發酵培養基。對實驗結果進行回歸分析，得到的回歸方程具有較高的擬合度，說明實驗結果可靠。優化后培養基成分為：蔗糖質量濃度102.9 g/L、酵母粉質量濃度2.5 g/L、K2HPO4質量濃度7.9 g/L、蛋白胨質量濃度18 g/L、MgSO4質量濃度2.5 g/L、NaCl質量濃度0.2 g/L、CH3COONa質量濃度1 g/L。優化后L-乳酸產量是優化前的3.4倍。實驗結果表明，該菌株營養需求簡單，產酸量可觀，發酵周期短。以蔗糖為最佳碳源說明其具有利用工業廢料糖蜜的潛力，從而降低L-乳酸生產成本。酵母粉對其生產L-乳酸起到至關重要的作用，但極少量的酵母粉即可滿足其需要。因此該菌種具有相當的工業生產L-乳酸的潛力。

[1]MOON S K, WEE Y J, CHOI G W.A novel lactic acid bacterium for the production of high purity L-lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp.paracasei CHB2121[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 114(2): 155-159.

[2]ABDEL-RAHMAN M A, TASHIRO Y, SONOMOTO K.Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: overview and limits[J].Journal of Biotechnology, 2011,156(4): 286-301.

[3]于雷, 雷霆, 裴曉林, 等.應用基因組改組選育耐糖L-乳酸高產菌株[J].食品科學, 2007, 28(9): 369-373.

[4]MARTINEZ F A C, BALCIUNAS E M, SALGADO J M, et al.Lactic acid properties, applications and production: a review[J].Trends in Food Science & Technology, 2013, 30(1): 70-83.

[5]SHI Zhouming, WEI Peilian, ZHU Xiangcheng, et al.Efficient production of L-lactic acid from hydrolysate of Jerusalem artichoke with immobilized cells of Lactococcus lactis in fibrous bed bioreactors[J].Enzyme and Microbial Technology, 2012, 51(5): 263-268.

[6]PETROV K, URSHEV Z, PETROVA P.L(+)-Lactic acid production from starch by a novel amylolytic Lactococcus lactis subsp.lactis B84[J].Food Microbiology, 2008, 25(4): 550-557.

[7]王秀麗, 任曉冬, 陳萍萍, 等.統計學分析方法應用于乳酸乳球菌培養基的優化[J].吉林大學學報: 理學版, 2010, 48(2): 323-328.

[8]ZHANG Guiying, MILLS D A, BLOCK D E.Development of chemically defined media supporting high-cell-density growth of lactococci, enterococci, and streptococci[J].Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(4): 1080-1087.

[9]代志凱, 張翠, 阮征.試驗設計和優化及其在發酵培養基優化中的應用[J].微生物學通報, 2010, 37(6): 894-903.

[10]NGUYEN C M, KIM J S, HWANG H J, et al.Production of L-lactic acid from a green microalga, Hydrodictyon reticulum, by Lactobacillus paracasei LA104 isolated from the traditional Korean food,makgeolli[J].Bioresource Technology, 2012, 110: 552-559.

[11]GAO Ting, HO K P.L-Lactic acid production by Bacillus subtilis MUR1 in continuous culture[J].Journal of Biotechnology, 2013,168(4): 646-651.

[12]于雷.基因組改組技術對鼠李糖乳桿菌的分子育種及其L-乳酸的發酵[D].長春: 吉林大學, 2007: 76-77.

[13]KADAM S R, PATIL S S, BASTAWDE K B, et al.Strain improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production[J].Process Biochemistry, 2006, 41(1): 120-126.

[14]王玉華, 陳萍, 樸春紅, 等.基因組改組鼠李糖乳桿菌生產L-乳酸發酵培養基的優化[J].食品科學, 2009, 30(21): 316-319.

[15]秦浩.高產L-乳酸菌株的選育及其發酵條件的研究[D].無錫: 江南大學, 2012: 25-26.

[16]吳再強, 鄒慧斌, 季更生, 等.一株干酪乳桿菌ZW-63A產高光學純L-乳酸的發酵優化研究[J].食品工業科技, 2013, 34(17): 226-231.

[17]高江婧.產L-乳酸菌種的選育和發酵條件的研究[D].無錫: 江南大學, 2009: 23-24.

[18]裴曉林.應用基因組改組技術選育L-乳酸高產菌株及其發酵工藝研究[D].長春: 吉林大學, 2007: 57-58.

[19]張為巍, 李元媛, 周銘鋒, 等.產L-乳酸的鼠李糖乳桿菌發酵培養基的優化[J].廣州化工, 2012, 40(7): 79-82.

[20]吳暉, 李明陽, 劉冬梅, 等.鼠李糖乳桿菌發酵生產L-乳酸培養基的優化[J].食品工業科技, 2008, 29(4): 81-84.

[21]LAOPAIBOON P, THANI A, LEELAVATCHARAMAS V, et al.Acid hydrolysis of sugarcane bagasse for lactic acid production[J].Bioresource Technology, 2010, 101(3): 1036-1043.

[22]RAMCHANDRAN L, SANCIOLO P, VASILJEVIC T, et al.Improving cell yield and lactic acid production of Lactococcus lactis ssp.cremoris by a novel submerged membrane fermentation process[J].Journal of Membrane Science, 2012, 403/404: 179-187.

[23]UENO T, OZAWA Y, ISHIKAWA M, et al.Lactic acid production using two food processing wastes, canned pineapple syrup and grape invertase, as substrate and enzyme[J].Biotechnology Letters, 2003,25(7): 573-577.

[24]S I R I S A N S A N E E Y A K U L S, L U A N G P I P A T T,VANICHSRIRATANA W, et al.Optimization of lactic acid production by immobilized Lactococcus lactis IO-1[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2007, 34(5): 381-391.