吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮純化工藝條件優(yōu)化

陳曉俠，宋 淵，張紀(jì)柏，王增利,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193；3.國(guó)內(nèi)貿(mào)易工程設(shè)計(jì)研究院，北京 100069）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又名北蟲(chóng)草，與冬蟲(chóng)夏草是同屬的藥用真菌，是子囊菌亞門(mén)、麥角菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬的模式種[1]。我國(guó)是世界上最早認(rèn)識(shí)并利用冬蟲(chóng)夏草的國(guó)家，早在公元前2000年就有了蟲(chóng)草的記載[2]，現(xiàn)在已經(jīng)成為重要的中醫(yī)藥資源之一[3]，與冬蟲(chóng)夏草有著類(lèi)似功效的蛹蟲(chóng)草在2009年被批準(zhǔn)為新資源食品[4]。

近年來(lái)，蛹蟲(chóng)草生理活性、功能成分和人工培育等方面的研究成為新的熱點(diǎn)。研究表明，蛹蟲(chóng)草具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗疲勞[7]、抗衰老[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、降血脂[10]、消炎和抗病毒[11]等生理作用，與冬蟲(chóng)夏草功能性相似；另外，冬蟲(chóng)夏草含有的腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、黃酮等功能性成分在人工培育的蛹蟲(chóng)草中均有存在，且含量相近甚至蛹蟲(chóng)草中更為豐富[12]，蛹蟲(chóng)草成為冬蟲(chóng)夏草的潛在替代品。

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)以C6-C3-C6為骨架的化合物總稱(chēng)，包括黃酮、異黃酮、查耳酮等類(lèi)，多數(shù)黃酮類(lèi)化合物分子式中含酚羥基，顯酸性，可溶于水、乙醇、甲醇及稀堿溶液等溶劑，可與Al3+發(fā)生螯合反應(yīng)，反應(yīng)形成的絡(luò)合物在紫外光下呈現(xiàn)熒光[13]。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)天然抗氧化劑，具有抗衰老[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]、預(yù)防心血管疾病[16]等生理功效，并被列為保健食品的功能因子之一[17]。

黃酮類(lèi)化合物分離純化方法較多，常見(jiàn)的有鉛鹽沉淀法、氧化鋁層析法、吸附樹(shù)脂層析法等，尤其是吸附樹(shù)脂柱層析因其上樣量大、分離效果好、操作簡(jiǎn)單、樹(shù)脂可以重復(fù)利用等優(yōu)勢(shì)，在黃酮分離純化中得到廣泛應(yīng)用[18]。吸附樹(shù)脂根據(jù)其極性不同可分為非極性、弱極性、中等極性、極性和強(qiáng)極性等多種類(lèi)型，根據(jù)骨架不同可分為聚苯乙烯型、聚丙烯酸型等類(lèi)型，在黃酮類(lèi)化合物純化中常用的吸附樹(shù)脂包括AB-8[19]、D-101[20]、NKA-9[21]和NKA-Ⅱ[22]等類(lèi)型。

Jiang等[23]利用樹(shù)脂從蛹蟲(chóng)草中分離純化得到一種具有抑制HIV病毒活性的黃酮類(lèi)化合物，但并未對(duì)其純化條件進(jìn)行優(yōu)化和進(jìn)一步研究。本研究以蛹蟲(chóng)草中黃酮類(lèi)化合物作為研究對(duì)象，探討了黃酮類(lèi)化合物純化中常用的4 種吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的分離效果，并對(duì)其中的一種理想樹(shù)脂進(jìn)行了純化工藝的優(yōu)化，對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的分離純化起到借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體由北京市農(nóng)林科學(xué)院培養(yǎng)獲得，菌種號(hào)為SX-08。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；AB-8、D-101、NKA-9、NKA-Ⅱ吸附樹(shù)脂（參數(shù)見(jiàn)表1） 南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)；其他試劑（均為分析純） 北京化工廠(chǎng)。

表1 實(shí)驗(yàn)用吸附樹(shù)脂主要參數(shù)Table1 The main parameters of macroporous adsorption resins used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；RE-5A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪儀器廠(chǎng)；HL-2恒流泵上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 吸附樹(shù)脂預(yù)處理

樹(shù)脂凈品用2 倍體積的無(wú)水乙醇浸泡10 h，徹底排出空洞中的氣泡并使其充分溶脹。去除乙醇后，樹(shù)脂用去離子水洗滌至洗滌液無(wú)白色混濁且無(wú)醇味，后用2倍體積的5% NaOH溶液充分浸泡3 h。去除堿溶液后，樹(shù)脂用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，后用2倍體積的5% HCl溶液充分浸泡3 h。去除酸溶液后，樹(shù)脂用去離子水洗滌至洗滌液呈中性[24]，備用。

采用濕法進(jìn)行吸附樹(shù)脂裝柱（樹(shù)脂層析柱內(nèi)徑17 mm，長(zhǎng)度500 mm），裝柱體積為100 mL。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定

1.3.2.1 黃酮含量工作曲線(xiàn)繪制

黃酮含量測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制參考文獻(xiàn)[25]。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，用95%乙醇溶液溶解并定溶于25 mL棕色容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，備用。分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于6 支20 mL刻度試管中，依次向試管中加入5% NaNO2溶液0.50 mL，混勻。靜置6 min后，依次向試管中加入10% Al(NO3)3溶液0.50 mL，混勻。靜置6 min后，依次向試管中加入4% NaOH溶液4.00 mL，用去離子水定容至10 mL，混勻。靜置30 min后，以試劑為空白，利用分光光度計(jì)于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制工作曲線(xiàn)。得蘆丁含量X與吸光度Y的工作曲線(xiàn)：Y=1.164X－0.012 6，R2=0.998 4。

1.3.2.2 樣品溶液中黃酮含量測(cè)定

取適量樣品溶液，按照上述條件測(cè)定樣品溶液的吸光度，根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算樣品中的黃酮含量。

1.3.3 粗品溶液制備

蛹蟲(chóng)草干子實(shí)體粉碎后過(guò)60 目鐵篩，用75%的乙醇溶液室溫浸提2 次，第一次浸提料液比為1∶20（g/mL），浸提24 h，第二次浸提料液比為1∶15，浸提24 h。乙醇浸提液過(guò)濾除去殘?jiān)蟮靡掖继崛∫?，?0℃條件下真空濃縮乙醇提取液至浸膏狀。用5% NaOH溶液重新溶解浸膏，過(guò)濾除去不溶物得黃酮堿提取液。向堿提取液中滴加濃鹽酸至pH 5，靜置1 h后，過(guò)濾去除酸溶物，收集沉淀，沉淀干燥后得黃酮粗品，黃酮粗品用75%乙醇溶液重新溶解，配成質(zhì)量濃度為（1.188 4±0.001 6） mg/mL的黃酮母液，備用。

1.3.4 吸附樹(shù)脂的篩選

1.3.4.1 吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附

準(zhǔn)確稱(chēng)取活化并干燥后的4 種吸附樹(shù)脂0.50 g，分別置于300 mL具塞三角瓶中，向各個(gè)三角瓶中依次準(zhǔn)確加入黃酮母液30.0 mL。塞緊瓶塞后置于搖床上，25℃條件下振蕩吸附24 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。測(cè)定吸附24 h后母液中剩余黃酮的質(zhì)量濃度，并按照公式（1）分別計(jì)算4種吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮的單位吸附量。

式中：Q為吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮的單位吸附量/（mg/g）；ρ0、ρ1分別為吸附前后母液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為黃酮母液的加入量/mL；m為吸附質(zhì)量/g。

1.3.4.2 吸附樹(shù)脂解吸

去除1.3.4.1節(jié)中吸附后的殘液，得到充分吸附了黃酮的吸附樹(shù)脂，向具塞三角瓶中分別準(zhǔn)確加入60.0 mL 95%的乙醇溶液，塞緊瓶塞后置于搖床上，25℃條件下振蕩解吸24 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。測(cè)定解吸24 h后解吸液中黃酮的質(zhì)量濃度，并按照公式（2）分別計(jì)算4種吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮的解吸率。

式中：ρ2為解吸液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為解吸液體積/mL；Q’為吸附樹(shù)脂吸附的黃酮量/mg。

1.3.4.3 吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)

準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理并干燥后的4種吸附樹(shù)脂0.50 g，分別置于300 mL具塞三角瓶中，向各個(gè)三角瓶中準(zhǔn)確加入黃酮母液30.0 mL。塞緊瓶塞后置于搖床上，25℃條件下振蕩吸附，轉(zhuǎn)速為100 r/min。每隔一定時(shí)間，吸取0.50 mL黃酮母液，測(cè)定母液中剩余黃酮的質(zhì)量濃度，直至母液中剩余黃酮質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。以樹(shù)脂對(duì)黃酮的單位吸附量（mg/g）為縱坐標(biāo)，以吸附時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

1.3.5 吸附樹(shù)脂分離純化蛹蟲(chóng)草黃酮工藝優(yōu)化

以1.3.4節(jié)中篩選出的吸附樹(shù)脂為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)蛹蟲(chóng)草中黃酮純化工藝進(jìn)行研究。

1.3.5.1 上樣體積確定

分別準(zhǔn)確吸取黃酮母液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mL，用去離子水稀釋至50.0 mL，上柱。母液上柱完畢后穩(wěn)定吸附30 min，然后用大量去離子水淋洗，利用濃硫酸檢測(cè)流出液中是否含糖，淋洗至流出液無(wú)色無(wú)糖。用大量95%乙醇溶液洗脫吸附樹(shù)脂，洗脫速率為2 BV/h，收集黃酮洗脫液，流出液無(wú)色且與AlCl3和FeCl3溶液反應(yīng)顯陰性時(shí)結(jié)束洗脫。分別測(cè)定各組洗脫液的體積和黃酮質(zhì)量濃度。按照公式（3）計(jì)算不同上樣體積時(shí)黃酮的解吸率，并根據(jù)解吸率確定黃酮上樣體積。

式中：ρ0、ρ’分別為母液和洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V、V’分別為母液和洗脫液的體積/mL。

1.3.5.2 淋洗液pH值確定

根據(jù)1.3.5.1節(jié)確定的上樣體積，對(duì)黃酮母液進(jìn)行上柱。上柱完畢后穩(wěn)定吸附30 min，然后分別用pH值為2、3、4、5、6、7的淋洗液淋洗，利用濃硫酸檢測(cè)流出液中是否含糖，淋洗至流出液無(wú)色無(wú)糖。用大量95%乙醇溶液洗脫吸附樹(shù)脂，洗脫速率為2 BV/h，收集黃酮洗脫液，流出液無(wú)色且與AlCl3和FeCl3溶液反應(yīng)顯陰性時(shí)結(jié)束洗脫。分別測(cè)定各組洗脫液的體積和黃酮質(zhì)量濃度。按照公式（3）計(jì)算淋洗液不同pH值條件下黃酮的解吸率，并根據(jù)解吸率確定淋洗液的pH值。

1.3.5.3 洗脫液體積分?jǐn)?shù)確定

根據(jù)1.3.5.1節(jié)確定的上樣體積，對(duì)黃酮母液進(jìn)行上柱。上柱完畢后穩(wěn)定吸附30 min，然后用1.3.5.2節(jié)中確定的淋洗液pH值淋洗，利用濃硫酸檢測(cè)流出液中是否含糖，淋洗至流出液無(wú)色無(wú)糖。分別用80%、85%、90%、95%、100%乙醇溶液洗脫吸附樹(shù)脂，洗脫速率為2 BV/h，收集黃酮洗脫液，流出液無(wú)色且與AlCl3和FeCl3溶液反應(yīng)顯陰性時(shí)結(jié)束洗脫。分別測(cè)定各組洗脫液的體積和黃酮質(zhì)量濃度及干燥后干物質(zhì)的質(zhì)量。按照公式（3）計(jì)算不同洗脫液體積分?jǐn)?shù)條件下黃酮的解吸率，并按照公式（4）計(jì)算不同洗脫液洗脫后黃酮純度，最后確定洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)。

式中：ρ’為洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V’為洗脫液體積/mL；m為洗脫液干燥后干物質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.5.4 洗脫液體積確定

根據(jù)1.3.5.1節(jié)確定的上樣體積，對(duì)黃酮母液進(jìn)行上柱。上柱完畢后穩(wěn)定吸附30 min，然后用1.3.5.2節(jié)中確定的淋洗液pH值淋洗，利用濃硫酸檢測(cè)流出液中是否含糖，淋洗至流出液無(wú)色無(wú)糖。用1.3.5.3節(jié)中確定的洗脫液體積分?jǐn)?shù)洗脫吸附樹(shù)脂，洗脫速率為2 BV/h，收集黃酮洗脫液，每100 mL洗脫液收集1管，直至流出液無(wú)色且與AlCl3和FeCl3溶液反應(yīng)顯陰性時(shí)結(jié)束洗脫。測(cè)定各組洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線(xiàn)，并確定洗脫液體積。

1.3.5.5 吸附樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)確定

根據(jù)1.3.5.1～1.3.5.4節(jié)確定的條件，在同一根吸附樹(shù)脂柱上重復(fù)上柱、淋洗、洗脫，分別測(cè)定每次洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算黃酮回收率，當(dāng)黃酮回收率低于60%時(shí)不再重復(fù)使用，最后確定同一根樹(shù)脂柱的使用次數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附樹(shù)脂篩選

2.1.1 吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附

由圖1可見(jiàn)，極性較弱的AB-8和D-101兩種樹(shù)脂更容易吸附蛹蟲(chóng)草黃酮，單位吸附量均可達(dá)到60 mg/g左右，且無(wú)顯著性差異（P＞0.05），極性樹(shù)脂NKA-9和NKA-Ⅱ?qū)S酮的吸附能力較前兩種樹(shù)脂較弱（P＜0.05）。影響吸附樹(shù)脂吸附能力的主要因素有吸附劑的極性和空間結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉國(guó)慶等[26]于大豆乳清廢水中黃酮吸附特性的研究中結(jié)論一致，說(shuō)明蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中黃酮主要以苷元形式存在，極性相對(duì)較弱。

圖1 樹(shù)脂種類(lèi)對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮單位吸附量的影響Fig.1 Adsorption quantities of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

2.1.2 吸附樹(shù)脂解吸

圖2 樹(shù)脂種類(lèi)對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的解吸率的影響Fig.2 Desorption rates of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

由圖2可知，AB-8和NKA-Ⅱ兩種樹(shù)脂吸附黃酮后更易于解吸，解吸率均達(dá)90%以上，D-101和NKA-9兩種樹(shù)脂的黃酮解吸率較前兩者低（P＜0.05）。結(jié)合4種吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮的單位吸附量測(cè)定結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮有良好的吸附能力，并且易于解吸，較適宜選作純化用樹(shù)脂；D-101樹(shù)脂對(duì)黃酮雖有良好的吸附能力，但解吸率較低，表明該樹(shù)脂極性與蛹蟲(chóng)草黃酮極性更為相近；NKA-Ⅱ樹(shù)脂雖有較高的解吸率，但對(duì)黃酮的吸附能力較弱，限制了蛹蟲(chóng)草黃酮分離純化的效率；NKA-9樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮既無(wú)良好的吸附能力，又不易于解吸，不適合本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的分離純化。

2.1.3 吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮吸附動(dòng)力學(xué)特性與后續(xù)分離純化工藝有著密切關(guān)系，在吸附時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，部分效率較低的樹(shù)脂也可能有較高的吸附量。為了進(jìn)一步確定理想樹(shù)脂種類(lèi)，對(duì)4種吸附樹(shù)脂進(jìn)行了吸附動(dòng)力學(xué)研究，并測(cè)定了各種樹(shù)脂的吸附速率，見(jiàn)圖3。AB-8和D-101兩種樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮均有很高的吸附速率，在0.5 h時(shí)均可達(dá)到飽和吸附，且單位吸附量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；樹(shù)脂NKA-9在吸附0.5 h后也接近其飽和吸附量，但較前兩種樹(shù)脂，單位吸附量較低（P＜0.05）；而樹(shù)脂NKA-Ⅱ不但吸附飽和時(shí)單位吸附量較低，而且在4 h左右時(shí)才達(dá)到飽和吸附，吸附速率也較慢。說(shuō)明NKA-9與NKA-Ⅱ樹(shù)脂極性、空間結(jié)構(gòu)與蛹蟲(chóng)草黃酮分子和空間結(jié)構(gòu)不符[21]，吸附能力較弱，不利于蛹蟲(chóng)草黃酮的分離純化。結(jié)合4 種吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附率和解吸率實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，AB-8吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮具有良好的吸附能力和較高的吸附速率，且易于解吸，是蛹蟲(chóng)草黃酮樹(shù)脂分離純化的理想樹(shù)脂。同時(shí)，靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明在上樣30 min后，AB-8樹(shù)脂即對(duì)黃酮達(dá)到穩(wěn)定吸附的效果。

圖3 不同樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.3 Static adsorption dynamic curves of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

2.2 AB-8吸附樹(shù)脂分離純化蛹蟲(chóng)草黃酮工藝優(yōu)化

2.2.1 上樣體積確定

圖4 不同上樣體積條件下蛹蟲(chóng)草黃酮的回收率Fig.4 Recoveries of flavonoids from Cordyceps militaris using different sample volumes

實(shí)驗(yàn)中蛹蟲(chóng)草黃酮質(zhì)量濃度為1.188 4 mg/mL，從圖4可以看出，上樣體積少于40 mL時(shí)，隨著上樣體積的增加，黃酮的回收率也隨之增加；當(dāng)上樣體積超過(guò)40 mL后，回收率隨著上樣體積的增加而下降；在上樣體積為40 mL時(shí)，黃酮的回收率最高（P＜0.05），達(dá)到82.82%。分析認(rèn)為，在低上樣體積時(shí)，樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附作用使其難以完全解吸，造成洗脫不徹底，黃酮回收率較低，當(dāng)上樣體積過(guò)大時(shí)，樹(shù)脂未能對(duì)黃酮完全吸附，并在淋洗過(guò)程中造成泄漏損失。因此，本實(shí)驗(yàn)中100 mL吸附樹(shù)脂的黃酮溶液上樣體積確定為40 mL，其中含有黃酮47.536 mg。

2.2.2 淋洗液pH值確定

圖5 淋洗液不同pH值條件下蛹蟲(chóng)草黃酮的回收率Fig.5 Recoveries of flavonoids from Cordyceps militaris using different eluent pH values

黃酮分子中含有大量酚羥基，通常情況下顯酸性，淋洗時(shí)，淋洗液pH值可以影響其分子的存在形式，進(jìn)而影響樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附能力。從圖5可以看出，用不同pH值的淋洗液對(duì)樹(shù)脂淋洗后，黃酮的回收率顯著不同（P＜0.05）。黃酮回收率隨著淋洗液pH值的上升呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢(shì)，淋洗液pH 5時(shí)，黃酮回收率最高，達(dá)到88.66%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與駱黨委[19]、李春美[27]等的研究結(jié)果不同，與石鳳英等[28]在兩色金雞菊總黃酮純化工藝中的研究結(jié)果一致，此種現(xiàn)象從另一角度印證說(shuō)明蛹蟲(chóng)草中黃酮極性較弱，與苷元結(jié)合的形式存在有關(guān)。在pH 5時(shí)，黃酮類(lèi)化合物呈分子態(tài)，極性較弱，與AB-8吸附樹(shù)脂穩(wěn)定吸附，不容易被淋洗液洗脫。因此，本實(shí)驗(yàn)確定分離純化中淋洗液pH值為5。

2.2.3 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)確定

根據(jù)化合物的相似相容原理，與洗脫液的極性相近的化合物更容易被洗脫，理想的洗脫液應(yīng)使目標(biāo)化合物同時(shí)具有較高的純度和回收率，但現(xiàn)實(shí)情況中難以達(dá)到，往往是在保證回收率的基礎(chǔ)上盡可能提高目標(biāo)化合物的純度[27]。

圖6 洗脫液不同體積分?jǐn)?shù)條件下蛹蟲(chóng)草黃酮的回收率和純度Fig.6 Recoveries and purities of flavonoids from Cordyceps militaris using different ethanol concentrations

實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)AB-8吸附樹(shù)脂分離純化的黃酮粗品純度為4.13%。從圖6可以看出，經(jīng)純化后黃酮純度均有不同程度的提高，但隨著黃酮純度的提高，回收率逐漸降低，說(shuō)明在洗脫液洗脫過(guò)程中，雜質(zhì)去除的同時(shí)會(huì)有黃酮化合物的部分損失，此時(shí)，應(yīng)遵循在保證回收率的基礎(chǔ)上盡可能提高純度的純化原則。經(jīng)分析后認(rèn)為，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，黃酮的回收率達(dá)到77.85%，純度達(dá)到17.24%，具有較高的黃酮回收率和純度，確定其作為分離純化的洗脫液體積分?jǐn)?shù)。

2.2.4 洗脫液體積確定

吸附樹(shù)脂的吸附作用使黃酮難以完全洗脫，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間可以提高黃酮的回收率，但同時(shí)也增加了有機(jī)試劑的使用量，造成經(jīng)濟(jì)和時(shí)間上的浪費(fèi)，因此，確定適宜的洗脫液體積不僅可以保證黃酮有較高的回收率，也縮短了洗脫時(shí)間、減少了試劑的浪費(fèi)。

圖7 洗脫液中黃酮含量隨洗脫液體積的變化Fig.7 Elution curves of flavonoids from Cordyceps militaris

從圖7可以看出，每100 mL洗脫液中黃酮含量呈近似正態(tài)分布，經(jīng)計(jì)算分析，500 mL洗脫液中黃酮總量為34.322 3 mg，占洗脫液中黃酮總量的92.27%，之后洗脫液中黃酮含量很低（P＜0.05），已不具有收集價(jià)值，因此，確定洗脫液體積為500 mL，即5倍柱體積。

2.2.5 吸附樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)確定

吸附樹(shù)脂具有可再生、可重復(fù)使用的特點(diǎn)，但分離純化樣品之后，吸附樹(shù)脂會(huì)吸附部分雜質(zhì)，降低了自身的分離效果，一般情況下吸附樹(shù)脂在分離純化3～4 次后回收率降低至60%以下，需要活化再生后才能再次使用[29]。AB-8吸附樹(shù)脂在重復(fù)使用3 次時(shí)，黃酮回收率為52.08%，低于60%的預(yù)設(shè)下限（P＜0.05）（圖8）。因此，確定同一根吸附樹(shù)脂重復(fù)使用2次后需再生活化。

圖8 不同重復(fù)使用次數(shù)條件下黃酮的回收率Fig.8 Recoveries of flavonoids after repeated uses of AB-8

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)AB-8、D-101、NKA-9和NKA-Ⅱ 4 種吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮的靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸和靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)等特性的研究，發(fā)現(xiàn)AB-8吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮有較高的吸附速率和單位吸附量，且易于解吸，是蛹蟲(chóng)草黃酮分離的理想樹(shù)脂。

確定AB-8吸附樹(shù)脂對(duì)蛹蟲(chóng)草黃酮分離純化的最優(yōu)工藝條件：樹(shù)脂裝柱體積為100 mL時(shí)，最佳上樣體積40.0 mL、黃酮上樣量47.536 mg、淋洗和洗脫速率2 BV/h、淋洗液pH 5、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)和體積分別為85%和500 mL，樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)為2次。在此條件下，蛹蟲(chóng)草黃酮的回收率在65%以上，純度在17%以上，具有良好的分離純化效果。

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