生活污泥與秸稈混合發(fā)酵微生物菌株的篩選及拮抗關(guān)系研究

吳金男楊浩深 梁劍光宋廷鴻 馬國勝 尹凡梁先龍 季群

（1常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 江蘇常熟 2155002蘇州榮基生態(tài)生物科技有限公司 江蘇吳江 215222）

污泥是一種可利用的有機(jī)固體廢物，尤其是一種可再生的生物資源。由于污泥中含有大量促進(jìn)植物生長的有機(jī)物質(zhì)和豐富的氮磷鉀等營養(yǎng)成分以及多種微量元素，因此是重要的有機(jī)肥資源和良好的土壤改良劑。污泥堆肥施入土壤后可增加土壤的保水和透氣性，提高土壤的排水能力。但是，我國污泥處置的現(xiàn)狀仍然相當(dāng)嚴(yán)峻，將近90%的生活污泥沒有得到很好的處理，由此造成的污染與二次污染問題也不容忽視[1]。污泥堆制發(fā)酵是一種很好的生物處理方式。在微生物的作用下，污泥的臭味可以大大降低并消除其中的有害物質(zhì)，可以作為土壤的有機(jī)肥料或者土壤改良劑，實(shí)現(xiàn)廢棄物的無害化和資源化[2-4]。本研究通過對秸稈粉和生活污泥混合堆肥的方法，篩選出有利于污泥堆肥處理的微生物。通過研究他們之間的拮抗關(guān)系，為以后采用人工接種的方法進(jìn)行混合菌群堆肥發(fā)酵、實(shí)現(xiàn)污泥的無害化處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生活污泥、秸稈粉，由蘇州榮基生態(tài)生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌株分離及拮抗試驗(yàn)培養(yǎng)基

牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂 15～25g，水1000mL，pH 7.4～7.6。

1.2.2 生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基

耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基：采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基改變NaCl濃度分別為5%、7.5%、10%、15%。

淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加0.2%的可溶性淀粉，按倒平板的要求分裝。

休和利夫森二氏培養(yǎng)基：蛋白胨 2g，NaCl 5g，K2HPO40.2g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液3mL，pH7.0～7.4。

乙酰甲基甲醇試驗(yàn)培養(yǎng)基：肉汁胨培養(yǎng)液100mL，KNO3lg，pH7.0～7.6。

明膠水解培養(yǎng)基：蛋白胨5g，明膠100～150g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，NaCl5g，水 100mL，pH7.2～7.4。

硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基：KNO30.1g，蛋白胨2.5g，蒸餾水500mL，pH7.4。

1.3 方法

1.3.1 堆肥方法

采用靜態(tài)通風(fēng)發(fā)酵法堆肥。發(fā)酵容器規(guī)格為50cm×50cm×100cm。箱體分覆蓋層、物料層、墊料層、接液層四層，由隔離網(wǎng)隔離，接液層有通風(fēng)氣孔。物料按照秸稈與污泥質(zhì)量比1:1的比例混合均勻并添加適量麩皮。初始堆料含水率在60%左右，自然發(fā)酵至腐熟。

1.3.2 發(fā)酵料中細(xì)菌的分離純化

取發(fā)酵料，用無菌生理鹽水制成懸浮液，懸浮液振蕩30min后靜置5分鐘。取上清液，采用平板劃線法分離菌種，37℃培養(yǎng)48h后挑菌分離并進(jìn)行3次純化。

1.3.3 菌株初步鑒定

參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[5-6]，通過菌落的形態(tài)、個體形態(tài)、生理生化特征等項(xiàng)目的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 拮抗實(shí)驗(yàn)

采用平板對峙培養(yǎng)法。在保證菌落之間能相遇的距離內(nèi)，于平板上同時(shí)點(diǎn)接不同種微生物菌株，一定條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察菌落之間有無拮抗。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 菌株分離

發(fā)酵15天后，堆肥已腐熟穩(wěn)定。堆肥表觀指標(biāo)：堆料呈深棕褐色松散狀，無臭，含水率在40%以下。從發(fā)酵料中分離篩選到九個菌株，分別編號為菌株Z1-Z9。

2.1.2 分離菌株的形態(tài)

從菌落形態(tài)看，Z-1以及Z6～Z9菌株菌落干燥，不透明，表面有褶皺凸起，邊緣呈鋸齒狀，淡黃色。Z-2～Z4菌株菌落較濕潤，不透明，表面光滑平整，邊緣圓整，白色。從革蘭氏染色及鏡檢結(jié)果看，9個菌株均為革蘭氏陽性細(xì)菌。其中，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9個體形態(tài)比較相似，呈短鏈狀排列，有芽孢，芽孢中生或近中生。Z-2菌桿狀比其他菌稍長，有芽孢，呈長鏈狀排列。Z-3、Z-4、Z-5呈短桿狀，芽孢中生或近中生。

2.1.3 分離菌株的生理生化特征

耐鹽性試驗(yàn)表明，9個菌株在5%和7.5%NaCl培養(yǎng)基中均生長良好；當(dāng)鹽濃度達(dá)到10%以上時(shí)，Z-1、Z6和Z-8能生長，其它菌生長不良。

耐溫性試驗(yàn)表明，，50℃下9種菌都能很好的生長；60℃時(shí)，Z-1、Z6和Z-8能生長，其它菌生長不良。

根據(jù)個體形態(tài)、菌落特征、革蘭氏染色結(jié)果和生理生化特征，初步鑒定，Z-1、Z-6和Z-8為地衣芽孢桿菌，Z-7和Z-9為蠟狀芽孢桿菌，Z-2為類芽孢桿菌屬細(xì)菌、Z-3、Z-4和Z-5三個菌株為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

2.2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

拮抗是微生物在其生長過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對周圍環(huán)境其它微生物所產(chǎn)生的抑制作用，若微生物之間存在拮抗關(guān)系，則必須消除其拮抗作用后才能混合培養(yǎng)。

拮抗試驗(yàn)表明，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9細(xì)菌完全互不拮抗，Z-2、Z-3、Z-4、Z-5菌也完全互不拮抗；而上述兩組細(xì)菌之間拮抗關(guān)系不明顯，基本無拮抗。

2.3 分析討論

結(jié)合菌落形態(tài)、個體形態(tài)、革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》，可初步鑒定出9個菌株均為芽孢桿菌，分屬芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。拮抗試驗(yàn)表明，9個菌株之間基本沒有拮抗關(guān)系。本試驗(yàn)為下一步通過這些菌的混合培養(yǎng)制作混合微生物菌劑作為生活污泥與秸稈發(fā)酵的發(fā)酵劑為提供了依據(jù)。

[1]張辰.污水處理廠污泥處理處置技術(shù)政策解讀與污泥產(chǎn)業(yè)“十二五”展望[J].水工業(yè)市場,2010(4）:23-27.

[2]李國學(xué),張福鎖．固體廢物堆肥化與有機(jī)復(fù)合肥生產(chǎn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000．