響應(yīng)面法優(yōu)化野西瓜種子蛋白質(zhì)提取工藝

田童童，張 建

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

響應(yīng)面法優(yōu)化野西瓜種子蛋白質(zhì)提取工藝

田童童，張 建*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取野西瓜種子蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，以蛋白質(zhì)提取率作為響應(yīng)值，對(duì)溫度、pH值、提取時(shí)間和液料比進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)。試驗(yàn)得出的二次模型的相關(guān)系數(shù)R2=96.7%。蛋白質(zhì)的提取率主要受溶液的pH和液料比的影響。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析得出野西瓜種子中蛋白質(zhì)提取最佳條件為液料比23∶1（mL:g），提取時(shí)間50 min，pH值8.40和溫度45℃，該條件下經(jīng)模型預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)提取率為17.63%，實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為（17.19±0.09）%。

響應(yīng)面分析法；野西瓜子；優(yōu)化；蛋白質(zhì)提取

野西瓜（Capparis spinosa）為白花菜科山柑仔屬植物，又稱刺山柑、老鼠瓜、瓜兒菜、槌果藤、菠里克果和伯格-塔烏孜等[1-4]。野西瓜的藥用部位為葉、果和根皮，味辛苦，性溫。具有祛風(fēng)、除濕、通鼻竅、止淤消腫、止痛活血之功效；外敷患處治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和瘡毒。在新疆作為一種民族醫(yī)藥而被廣泛應(yīng)用[5-7]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)野西瓜的研究主要集中在對(duì)其成份進(jìn)行分析及油的利用方面，有關(guān)野西瓜種子蛋白質(zhì)提取的研究很少，鑒于此，本試驗(yàn)以新疆野西瓜為研究原料，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化其種子蛋白質(zhì)提取條件，并且對(duì)優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)際試驗(yàn)考察以驗(yàn)證響應(yīng)面模型的正確性。此外，該研究對(duì)新疆野西瓜的附加值的增值具有一定的促進(jìn)作用，同時(shí)為野西瓜今后的深度開發(fā)及利用提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野西瓜：購(gòu)買于石河子市友好超市。KH2PO4、Na2HPO4、NaOH、HCl均為分析純：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Millio-Q Grandient超純水系統(tǒng)：美國(guó)密理博公司；BL-206-II高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；DFY-500搖擺式高速粉碎機(jī)：溫州溫嶺市機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將野西瓜去皮得其野西瓜種子，在45℃烘箱中干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩得野西瓜種子粉末。將粉碎后的野西瓜種子與正己烷以1∶5（g∶mL）的比例混合浸泡2.5 h以除去其中的脂肪。脫脂后的野西瓜種子粉末再在45℃的烘箱中進(jìn)行干燥，然后繼續(xù)將其粉碎，粉碎后的樣品過(guò)120目篩，經(jīng)過(guò)上述處理的樣品裝入聚乙烯袋中在室溫下保藏備用。

1.3.2 野西瓜種子蛋白質(zhì)提取

稱取10 g的樣品于裝有0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）及pH 8.0、0.01%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）的玻璃燒杯中，在恒定的溫度下不斷的攪拌使其充分溶解。通過(guò)加入0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl來(lái)調(diào)節(jié)水解液的pH值使其保持恒定。然后將水解液于4 500 r/min的條件下離心20 min，合并上清液。并且采用福林酚法測(cè)定其中可溶性蛋白質(zhì)的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A660nm=8.132C+0.035 7（R2=0.997 8），所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。野西瓜種子蛋白質(zhì)提取率按下列公式計(jì)算：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白（牛血清蛋白）質(zhì)量濃度，mg/mL；A待測(cè)為樣品蛋白質(zhì)在660 nm的波長(zhǎng)下的吸光度值；m為試驗(yàn)用樣品野西瓜種子的質(zhì)量，g。

1.3.3 野西瓜子主要組成成分的測(cè)定

粗脂肪含量的測(cè)定方法參照GB/T 5512—2008《糧油檢驗(yàn)糧食中粗脂肪含量測(cè)定》；粗蛋白含量的測(cè)定方法參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；水分含量的測(cè)定方法參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；灰分含量的測(cè)定方法參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)水解液pH值，液料比，提取溫度，提取時(shí)間進(jìn)行單因素考察，然后利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取野西瓜子粗蛋白的條件。采用Design-Expert 8.0軟件的中心組合設(shè)計(jì)（centralcomposite designs，CCD）原理，以提取溫度（X1）、水解液pH值（X2）、提取時(shí)間（X3）、液料比（X4）4因素，以野西瓜子蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素5水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)的因素水平編碼如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 野西瓜子組成成分

野西瓜子的主要組成成分如表2所示。

由表2可知，野西瓜子粗蛋白的含量達(dá)到24.02%。但是QUANHANG L等[8]研究表明發(fā)芽的南瓜子中蛋白質(zhì)含量為24.5%～36.0%，MIZUBUTII Y等[9]研究表明樹豆中蛋白質(zhì)含量為15.5%～28.8%。RUSTOMIYS等[10]對(duì)花生中蛋白質(zhì)作了檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示花生蛋白的含量大概在22.04%左右。GUO T L等[11]利用響應(yīng)面方法從毛竹筍中提取蛋白質(zhì)，其含量最大為13.05%。結(jié)果表明，與其他植物蛋白源相比，野西瓜子中蛋白質(zhì)含量比較豐富，可以作為一個(gè)潛在的補(bǔ)充人體蛋白質(zhì)的來(lái)源。

2.2 模擬方程的建立及方差分析

以提取溫度（X1）、水解液pH值（X2）、提取時(shí)間（X3）、液料比（X4）為響應(yīng)變量，以野西瓜子蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。利用響應(yīng)面軟件Design Expert8.0對(duì)表3給出的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合和方差分析，得到的野西瓜子蛋白質(zhì)提取的多元線性回歸方程：

相關(guān)系數(shù)R2=0.966 8。

通過(guò)對(duì)比響應(yīng)面軟件中回歸模型給出的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)所得的實(shí)際值，試驗(yàn)得出結(jié)論，結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出二者擬合程度較好，二次多項(xiàng)模型的方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)P＜0.05時(shí)，影響因素對(duì)響應(yīng)值影響為差異顯著，當(dāng)P＜0.001時(shí)為差異高度顯著，P＜0.000 1時(shí)為差異極顯著[12-13]。方差分析表中顯示模型的P＜0.000 1，失擬項(xiàng)的P＞0.05，說(shuō)明試驗(yàn)選取的模型表現(xiàn)出高度的顯著性，失擬項(xiàng)不顯著，表明響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.966 8，更加說(shuō)明該模型的可信度較高。一般情況下，如果變異系數(shù)≤10%就說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂辛己玫闹貜?fù)性[14-15]。經(jīng)計(jì)算得到變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.65%，說(shuō)明響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)模型的合理性，可行性。

2.3 提取條件的優(yōu)化

提取溫度、pH值、提取時(shí)間、液料比對(duì)野西瓜種子蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖2。圖2A顯示了溫度和pH值對(duì)野西瓜種子蛋白質(zhì)的提取率的影響，可以觀察到pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響表現(xiàn)出二次關(guān)系，而溫度則為線性關(guān)系。隨著pH值不斷增加，蛋白質(zhì)提取率也在逐漸升高，然而溫度則對(duì)其影響不是很顯著。圖2B顯示的提取溫度與提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，可以明顯看出沒有曲面形成，沒有明顯表現(xiàn)出蛋白質(zhì)提取率增減的趨勢(shì)，又結(jié)合圖2A、圖2C可以得出提取時(shí)間與提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的交互影響不顯著。圖2C顯示了溫度和液料比對(duì)野西瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響，可以明顯看出溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響是呈現(xiàn)出線性關(guān)系，而液料比則顯示出二次影響，隨著提取溫度不斷升高，蛋白質(zhì)提取率沒有表現(xiàn)明顯的變化，而隨著液料比的不斷上升，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。圖2D表明pH值和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率都顯示出二次影響，二者之間的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響特別顯著。圖2E顯示的是pH值和液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，隨著pH值和液料比的增加，蛋白質(zhì)提取率也在不斷的上升。圖2F顯示的是提取時(shí)間和液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，隨著液料比的增加蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

應(yīng)用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.0本身自帶的最優(yōu)工藝參數(shù)統(tǒng)計(jì)模塊，由軟件給出的最優(yōu)野西瓜種子蛋白質(zhì)提取最佳工藝條件為：液料比23∶1（mL∶g），提取時(shí)間50 min，pH值8.40和溫度45℃，模型預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)提取率為17.63%。按照軟件給出的最優(yōu)工藝參數(shù)，進(jìn)行了至少3次試驗(yàn)，得到的蛋白質(zhì)提取率的平均值為（17.19±0.09）%，模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值相對(duì)偏差較小，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選模型具有很高的擬合性。

3 結(jié)論

從野西瓜種子中提取蛋白質(zhì)，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)了29組實(shí)驗(yàn)，其中考察的因素有溫度，pH值，液料比和提取時(shí)間。蛋白提取率的試驗(yàn)值變化范圍為13.32%至17.72%。通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)蛋白質(zhì)提取率做了二次模型的擬合，其表現(xiàn)出了顯著性的影響。pH值和液料比是影響最顯著的因素。野西瓜種子中蛋白質(zhì)提取最佳條件是：液料比23∶1（mL∶g），提取時(shí)間50 min，pH 8.40和溫度45℃，該條件下經(jīng)模型預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)提取率為17.63%，實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為（17.19±0.09）%，要稍微偏低于預(yù)測(cè)值。這對(duì)未來(lái)野西瓜的綜合開發(fā)、利用及提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，附加值具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)為其提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1]曾 艷，李 玲，聶禮飛，等.野西瓜低聚糖的提取及含量測(cè)定[J].生物技術(shù)，2009，19（2）：67-70.

[2]甘永祥，陳 文，王新春，等.刺山柑果實(shí)的化學(xué)成分[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（3）：334-336.

[3]楊海帆，于 蕾，龐琳琳，等.野西瓜正丁醇提取物的化學(xué)成分與抗腫瘤作用[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，25（3）：264-267.

[4]殷麗娜，王麗婷，楊敏麗.野西瓜苗揮發(fā)油對(duì)小菜蛾的活性作用方式[J].農(nóng)藥，2009，48（8）：617-619.

[5]李海嬌，于 蕾，劉光達(dá)，等.野西瓜水溶性生物堿的測(cè)定[J].中草藥，2009，40（S1）：288-289.

[6]李海嬌，于 蕾，劉光達(dá)，等.維藥野西瓜藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[C].2009年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第九屆中國(guó)藥師周論文集，2009.

[7]于 蕾，賀春朋，張小敏，等.野西瓜化學(xué)成分提取分離及抗氧化活性測(cè)定[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，27（4）：524-527.

[8]LIQ H,FU C L.Application ofresponse surface methodology for extraction of germinant pumpkin seeds protein[J].Food Chem,2005,92(4): 701-706.

[9]MIZUBUTI,IY,JUNIOR,O B,SOUZA,L WO,etal.Response surface methodology for extraction optimization of pigeon pea protein[J].Food Chem,2000,70(2):259-265.

[10]RUSTOMIY S,LOPEZ-LEIVA M H,NAIR B M.Optimization ofextraction of peanut proteins with water by response surface methodology [J].J Food Sci,1991,56(6):1660-1663.

[11]LV G T,LI J H,HUANG C X.Response surface methodology for extraction optimization of phyllostachys pubescens bamboo shoots protein [J].Adv Mater Res,2013,709(5):852-857.

[12]丁仲鵑，畢玉芬，戴 云，等.中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化蜂膠總多酚提取工藝[J].食品科學(xué)，2013，34（2）：17-21.

[13]王喜萍，李長(zhǎng)生.響應(yīng)面法優(yōu)化狍茸中活性成分提取工藝[J].食品科技，2014，39（2）：205-209.

[14]FIRATLIGIL-DURMUS E,EVRANUZ O.Response surface methodology for protein extraction optimization of red pepper seed(Capsicum frutescens)[J].Food Sci Technol,2010,43(2):226-231.

[15]李盈蕾，陳建華，孫吉佑，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)選黃花菜多糖提取工藝[J].中國(guó)釀造，2010，29（7）：72-75.

Optimization of protein extraction fromCapparis spinosa seeds by response surface methodology

TIAN Tongtong,ZHANG Jian*

(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

The optimum conditions for protein extraction from Capparis spinosa seeds were determined by response surface methodology.Using protein extraction ratio as evaluation index,a centralcomposite design was conducted using temperature,pH,extraction time and solid to liquid ratio as indexes.The quadratic correlation coefficientof the modelwas 96.7%.Results showed thatprotein yield was primarily affected by pH and solid to liquid ratio,and the optimalprotein extraction conditions from C.spinosa seeds were solid to liquid ratio 23:1(ml:g),time 50 min,pH 8.4 and temperature 45℃.Under these conditions,the predicted protein extraction ratio was 17.63%,and the experimentalvalue was(17.19±0.09)%.

response surface methodology;Capparis spinosa seeds;optimization;protein extraction

TS209

A

0254-5071（2015）02-0096-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.022

2014-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260366）；石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)（3152SPXY01027）

田童童（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。

*通訊作者：張 建（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。