籠養(yǎng)條件下花尾榛雞的遺傳多樣性分析

田萬年，鐘 寶 (長白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132101)

花尾榛雞(Bonasa bonasia)是雞形目雉科鳥類，俗稱飛龍，是東北地區(qū)典型的森林留鳥［1］。其在東北曾有大規(guī)模的分布，長期以來，因狩獵致使數(shù)量下降而成為國家Ⅱ級保護(hù)鳥類。目前國內(nèi)對其飼養(yǎng)繁育及疾病等方面進(jìn)行了較為深入的研究，但有關(guān)花尾榛雞的分子生態(tài)學(xué)方面研究尚未見報(bào)道。線粒體DNA(mtDNA)具有母性遺傳、進(jìn)化速率快、拷貝數(shù)多的特點(diǎn)，是目前生物體研究中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記之一。細(xì)胞色素b(Cyt b)是mtDNA編碼的呼吸鏈上重要的酶之一，作為一種高效的母系遺傳標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究［2］。筆者以分子生態(tài)學(xué)研究中使用最為普遍的mtDNA的控制區(qū)和細(xì)胞色素b(Cyt b)作為分子標(biāo)記，對花尾榛雞的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為制定科學(xué)的繁育計(jì)劃、對花尾榛雞進(jìn)行遺傳保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 吉林花尾榛雞來自吉林市左家珍禽養(yǎng)殖場，采集不同個(gè)體花尾榛雞抗凝血15份，置于冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ萌蚪M提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2 Cyt b基因的擴(kuò)增和序列測定 根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的松雞基因序列(AB120132)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對引物。上游引物P1:5＇-ATG GCA CCC AAC ATC CGA AAA T-3＇，下游引物 P2:5＇-TTA GTG GTT GAG TAT TTT GTT T-3＇，預(yù)期擴(kuò)增大小為1 143 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物的純化、回收和測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Clustal W(1.82)軟件進(jìn)行多序列比對，通過MEGA4.0軟件計(jì)算不同序列間的核苷酸代替、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換顛換比率及遺傳距離等。用DNAsp4.10軟件計(jì)算單倍型、單倍型多樣性、核苷酸多樣性。利用MEGA軟件計(jì)算品種間距離，利用UPGMA法構(gòu)建品種的分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 花尾榛雞Cyt b基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和測序結(jié)果得知，Cyt b基因PCR產(chǎn)物大小為1 143 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 花尾榛雞Cyt b基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的突變類型 通過對15條花尾榛雞Cyt b基因序列(15條序列由該試驗(yàn)測定，其余11條序列來源于GenBank)分析結(jié)果表明，所有序列全長均為1 143 bp，無插入和缺失，共發(fā)現(xiàn)12個(gè)變異位點(diǎn)，包括9個(gè)轉(zhuǎn)換和3個(gè)顛換。核苷酸的替換位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換為主，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚。12個(gè)變異位點(diǎn)定義了6種單倍型。

2.3 花尾榛雞Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用Clustal W(1.82)軟件對花尾榛雞mtDNA Cyt b序列進(jìn)行同源序列對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15只花尾榛雞Cyt b基因全序列由6種單倍型組成。結(jié)合所有的群體單倍型序列，并引用GenBank中的部分松雞科Cyt b基因序列，采用UPGMA法，以Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，基于Cyt b基因吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia(NC-020591)親緣關(guān)系最近，與斑尾榛雞(AF230166)處于一個(gè)分支，而北美榛雞屬(AF230167)單獨(dú)處于一個(gè)分支。黑琴雞(AF230166)、松雞(AF230179)和巖雷鳥(AY156346)共在一個(gè)分支上。

3 討論

花尾榛雞的肉質(zhì)口感細(xì)嫩，肉味極其鮮美且具有良好的滋補(bǔ)作用和扶正固本的藥效，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。近年來由于對花尾榛雞棲息地環(huán)境破壞及大量捕獵，花尾榛雞的野生數(shù)量急劇減少。目前，我國關(guān)于花尾榛雞的研究主要集中在人工馴養(yǎng)和養(yǎng)殖、疾病防治、飼料及營養(yǎng)、人工孵化及育雛等方面［4－8］。研究手段較單一，研究深度不夠，繁殖率低、幼雛成活率低等問題尚未能解決。因此，對花尾榛雞的遺傳、生理及進(jìn)化等方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究為花尾榛雞的保護(hù)及生產(chǎn)利用提供有效的保證。目前，對于花尾榛雞種群遺傳多樣性分析研究較少。楊秀芹等［9］對花尾榛雞MC4R基因進(jìn)行了克隆和序列分析。蔡曉淇［3］對花尾榛雞的系統(tǒng)地位與BLB基因多態(tài)性進(jìn)行了研究。該試驗(yàn)測定和分析了吉林地區(qū)花尾榛雞15只樣本的mtDNA Cyt b基因序列，共檢測到12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，定義了6種單倍型。

目前我國對松雞科鳥類的種屬分類存在爭議，最早認(rèn)為劃分為9屬。國內(nèi)學(xué)者通過形態(tài)、分子系統(tǒng)學(xué)等方法認(rèn)為應(yīng)將劃分為7屬或6屬。對于花尾榛雞的分類地位主要集中北美榛雞屬Bonasia和榛雞屬Tetrastes。該試驗(yàn)通過測定花尾榛雞mtDNA Cyt b基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，籠養(yǎng)吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia(NC－020591)親緣關(guān)系最近，與斑尾榛雞(AF230166)處于一個(gè)分支，而北美榛雞屬(AF230167)單獨(dú)處于一個(gè)分支。該研究支持花尾榛雞屬于松雞科榛雞屬，不應(yīng)并入北美榛雞屬，與包新康等［4］、蔡曉淇等［10］的觀點(diǎn)一致。

［1］朱井麗.長白山東部山區(qū)越冬期花尾榛雞種群密度及分布［J］.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，24(3):24－25.

［2］劉向華，王義權(quán)，劉忠權(quán)，等.從Cytb基因序列探討鹿亞科動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2003，24(1):27 －33.

［3］蔡曉淇.花尾榛雞的系統(tǒng)地位與BLB基因多態(tài)性研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2013.

［4］包新康，劉發(fā)，顧海軍，等.雞形目鳥類系統(tǒng)發(fā)生研究現(xiàn)狀［J］.動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，2008，33(4):720 －732.

［5］趙匠，易國棟，郝錫聯(lián)，等.珍禽花尾榛雞的研究現(xiàn)狀及展望［J］.吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2006(2):60－61.

［6］李愛國，李國君.花尾榛雞野生馴養(yǎng)方法［J］.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2009(10):8－9.

［7］杜繼紅，周玉秋.花尾榛雞的養(yǎng)殖［J］.中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2006，23(18):31－32.

［8］孫淑霞，薛茗元，張克勤.花尾榛雞人工飼養(yǎng)技術(shù)［J］.中國家禽，2014，36(6):55－58.

［9］楊秀芹，張冬杰，劉娣.環(huán)頸雉和花尾榛雞MC4R基因的克隆和序列分析［J］.中國畜牧雜志，2010，46(17):16 －18.

［10］蔡曉淇，白素英，金煜.松雞科13種鳥類COⅠ序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，2012，37(2):269－273.