線粒體DNA分子技術在斑點叉尾鮰物種鑒定中的應用

羅志萍，肖武漢，黃迎波，周慧平，袁曉芬，王華全

(1.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南長沙410004;2.中科院水生生物研究所，湖北武漢430022;3.湖北出入境檢驗檢疫局，湖北武漢430050)

斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)屬名貴淡水經濟魚類，深受美國、加拿大及其他國家消費者的喜愛。加工好的成品或半成品在美國、日本、歐洲和加拿大等地市場均暢銷，市場需求量極大。自1984年，我國湖北省水產研究所首次引進斑點叉尾鮰，隨著繁育、養殖以及加工技術的日趨成熟，再加上高額的投資回報效益，使得斑點叉尾鮰的養殖業和加工業在我國迅速蓬勃發展，出口創匯效益也逐年攀升。目前斑點叉尾鮰的養殖已遍及我國大部分省市，其中在湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、四川和廣東等地已大面積養殖。我國許多省區已將斑點叉尾鮰列為優勢品種，是開發扶持以促進其產業化和出口創匯的主要對象，已經形成了產供銷一條龍的產業鏈。

然而近年來，曾被美國政府視為“反傾銷”而遭封殺的越南巴沙魚借道中國貼著“中國斑點叉尾鮰”的標簽進入美國市場，嚴重損害我國斑點叉尾鮰的品牌，影響了我國斑點叉尾鮰產品的正常出口，擾亂了國際斑點叉尾鮰市場。由此導致美國FDA對中國出口的斑點叉尾鮰產品采取隨機檢查行動，以中國出口的成品或半成品中斑點叉尾鮰物種不符為由的退貨和通報事件，而且還有愈演愈烈之勢。由于目前尚無半成品斑點叉尾鮰中物種鑒定方法，面對國外技術貿易壁壘，我國斑點叉尾鮰出口貿易只能陷入被動局面。

對于已加工好的斑點叉尾鮰成品和半成品，由于形態已發生完全改變，主要依據骨骼結構和外部形態特征的傳統物種鑒定方法在斑點叉尾鮰的物種鑒定上已完全不適用。此外，在成品和半成品中，由于細胞結構的破壞和蛋白質的變性，依據染色體特征的細胞分類學方法以及依據同功酶數據的酶學鑒定方法等也同樣不適合斑點叉尾鮰的物種鑒定。由于DNA的相對穩定性和DNA序列數據的超敏感性，特別是線粒體DNA的高拷貝數，嘗試利用DNA分子數據，特別是線粒體DNA的序列數據，建立一種能被國際上普遍接受的物種鑒定方法和標準，才是切實可行的。

有關科技查新結果表明，國外已有線粒體DNA的PCRRFLP的數據進行鱈魚、比目魚等制品中物種鑒定的報道［1－14］，但均沒有線粒體DNA的D-loop區的分子數據來進行斑點叉尾鮰物種鑒定方面的報道。而PCR-RFLP方法操作過程繁瑣，多用于對同一物種的不同群體進行遺傳多態性分析，不適于快速、經濟的鑒定斑點叉尾鮰物種。線粒體DNA控制區具有個體和種群特異性，已被國際上廣泛地用來作為物種鑒定的標準，尤其是D-loop控制區，不同物種差異較大，可以準確鑒定物種。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 考慮到在實際國際貿易中被冒用的可能性，選用斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus、大口鲇Silurus meridionalis、革胡子鯰Clarias leather、鯉Cyprinus carpio和鯽 Carassius auratus，樣本取自長江水產研究所，取其肌肉組織用95%乙醇固定，保存于－20℃。

1.2 方法

1.2.1 引物設計。D-loop引物是根據NCBI數據庫斑點叉尾鮰已知序列自行設計。引物序列為:D-loopF:GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC;D-loopR:GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG。

COⅠ根據參考文獻采用通用引物，序列為:LCO-1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG;HCO-2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAT。

1.2.2 基因組DNA的提取和檢測。基因組DNA的提取采用常規的酚－氯仿抽提法，參考薩姆布魯克(2002)的方法和其他學者的研究方法［15－16］稍作改動。取用乙醇固定的尾鰭約0.1 g于2 ml離心管中，剪碎，置于37℃烘干。向離心管中加入500 μl抽提緩沖液，并加入RNaseA，至終濃度為20 μg/ml，37℃水浴1 h。然后向抽提緩沖液中加入蛋白酶K至終濃度為200 μg/ml，55℃水浴過夜。將消化好的樣品冷卻至室溫后，加入等體積的酚-氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，輕輕地上下顛倒10 min，使充分混勻，12 000 r/min離心10 min。用擴口槍頭小心地吸取上層水相至另一新的離心管中。吸取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，操作同上，重復抽提1次。吸上清，加入1/10體積的NaAc，輕搖混勻，加2倍體積－20℃預冷的無水乙醇，待有絮狀沉淀析出后，置于－20℃沉淀1～2 h。12 000 r/min離心10 min。棄上清，用4℃ 70%乙醇洗滌2次，4℃、10 000 r/min離心5 min，棄上清，讓沉淀自然風干，待白色沉淀變為無色透明時加入300 μl TE貯存液溶解DNA，保存于－20℃備用。用蛋白質–核酸檢測儀測定DNA的濃度和A260/A280。用0.8%的瓊脂糖凝膠(含10 mg/ml EB)對DNA樣品進行電泳，在凝膠成像系統中觀察、拍照，從電泳圖判斷提取DNA的質量。

1.2.3 基因擴增與檢測。PCR擴增的基本反應體系25.0 μl，包括10 × Taq DNA 聚合酶 2.5 μl，MgCl2(25 mmmol/L)2.0 μl;dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl;引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，DNA 模板(100 ng/μl)0.5 μl，Taq DNA 聚合酶(1 U/μl)1.0 μl，超純水 18.0 μl。

采用以上PCR反應體系對斑點叉尾鮰、革胡子鯰、大口鲇、鯉等進行PCR擴增。擴增反應的基本熱循環參數:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，54.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;最后72℃延伸10 min，然后降溫至12℃。

為擴增出特異性的目的條帶，在其他反應參數不變的條件下，調節退火溫度，最終得到條帶清晰的目的產物。

1.2.4 序列測定。對得到的斑點叉尾鮰D-loop和COⅠ片段進行膠回收，測序。

1.2.5 酶切鑒定。對測序得到的D-loop序列，用軟件DNA club查找酶切位點。經查找，在D-loop序列的200 bp處有一特異的酶切位點EcoRⅠ。利用此限制性內切酶分別對斑點叉尾鮰和革胡子鯰的D-loop序列進行酶切鑒定，37℃酶切3 h，電泳檢測。

酶切體系:10 × buffer 1 μl，EcoRⅠ0.5 μl;D-loop 8.5 μl。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取結果 采用常規的酚－氯仿法提取用乙醇固定的斑點叉尾鮰組織DNA，分子量約10 kb。取2～4 μl DNA樣品，在0.8%瓊脂糖上檢測，條帶純度和亮度都較高，幾乎無拖尾現象。用核酸蛋白儀進一步檢測顯示，DNA 濃度在400 ～1 500 ng/μl，A260/A280在1.65 ～1.82。因此該方法所提基因組DNA完全可以滿足線粒體D-loop擴增的要求。

2.2 PCR擴增結果 為擴增出特異性的目的條帶，在其他反應參數不變的條件下，調節退火溫度，最終得到條帶清晰的目的產物。其中，D-loop對應的最佳退火溫度為54.8℃，PCR擴增結果見圖1、2。

由圖1可知，只有斑點叉尾鮰和革胡子鯰可以利用所設計的特異性引物擴增出清晰的D-loop序列，說明兩者的親緣關系較近，可以作為斑點叉尾鮰區分于其他親緣關系較遠物種的方法。

由圖2可知，采用通用引物，在以上幾個物種中均可以擴增得到分子量大小相差不大的COⅠ片段，所以，僅用PCR擴增COⅠ序列不能區分斑點叉尾鮰和其他物種，需進一步測序鑒定。

2.3 測序及比對結果 測序得到斑點叉尾鮰的D-loop序列，經過Blast，D-loop序列與NCBI數據庫已有的序列一致性達到98%(圖3)。

斑點叉尾鮰與革胡子鯰D-loop比對結果見圖4。經過Blast，一致性為88%。

2.4 酶切鑒定結果 D-loop序列經EcoRⅠ酶切和電泳檢測，結果見圖5。由圖5可知，斑點叉尾鮰的D-loop序列被酶切成2個片段，大的分子量為900 bp左右，小的分子量為200 bp左右，而革胡子鯰的D-loop序列沒有被切開。由此可知，不需測序能夠簡單地鑒定出斑點叉尾鮰物種。

3 討論

該研究采用自行設計的引物對斑點叉尾鮰及其他幾個物種的D-loop和COⅠ區進行PCR擴增并測序，經比對發現不同物種之間的序列差異較大。建立的從斑點叉尾鮰肌肉組織中提取DNA的簡易方法能夠進行PCR擴增和序列分析，所測定的DNA序列正確無誤。這說明依據最小片斷的長度和序列設計的特異性PCR引物，在常規條件下很易擴增所需的線粒體DNA片段，所設計的PCR引物具有物種特異性。因此在大批量的產品檢驗中可以使用該引物進行擴增篩選，再根據D-loop和COⅠ序列的比對直接鑒定出斑點叉尾鮰。

為了進一步區分其近似物種，該研究測定斑點叉尾鮰近似物種和不同種群線粒體DNA的D-loop的序列，確定斑點叉尾鮰物種特異性的最短DNA序列片斷，在此基礎上尋找其酶切位點，并進行酶切鑒定。結果表明該方法建立的特異性酶切圖譜可以區分近似物種，在經過相對少的酶切和電泳后，不需測序能夠將斑點叉尾鮰與其他近似物種區分開來。

該研究采用線粒體DNA分子鑒定技術，在參閱國外斑點叉尾鮰線粒體DNA序列數據的基礎上，通過進一步探索和優化，建立了斑點叉尾鮰物種的快速分子鑒定方法并研制出檢測試劑盒，目前該技術已應用于水產品進出口貿易過程中物種真偽檢驗鑒定的技術執法工作。該研究成果為優化和提高檢驗檢疫執法運行效能提供了技術保障，為我國打破國外技術貿易壁壘、制定標準法規提供了技術支撐，同時也有助于我國水產品行業商業欺詐認定裁決工作。

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