中藥治療激素性骨壞死的蛋白質組學分析

作者單位：166200 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣人民醫院

【摘要】目的　利用中藥治療機理，根據蛋白質組學的研究方法對激素性骨壞死的病理進行研究，為臨床治療激素性骨壞死提供一些參考。方法 建立常用激素性骨壞死和中醫治療激素性骨壞死的大鼠模型對照組，并設立一組空白對照組，4周后根據骨形態學方法鑒定模型，確認成功后提取大鼠骨組織蛋白質樣品，運用蛋白質組學分析方法，針對得到的數據和圖譜進行進一步的研究。結果　三組大鼠骨組織總蛋白質分子的解剖圖譜和蛋白質肽指紋圖譜通過蛋白質組學分析發現，有三種蛋白質存在明顯差異。結論 在激素性骨壞死發病中發揮作用的阻凝蛋白重鏈ⅡB、磷脂谷胱甘肽過氧分酶及泛素化酶E2，亦影響了中藥對激素性骨壞死的治療結果，有著重要的調控作用。

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2015.10.194

Analysis of the Treatment of Glucocorticoid-induced Osteonecrosis With Traditional Chinese Medicine （TCM）in Proteomics

WU Pengfei Monggol Nationality Autonomous County People's Hospital，Daqing 166200，China

【Abstract】

Objective Using the mechanism of traditional Chinese medicine treatment，according to the research of the proteomic approach，to study of hormone osteonecrosis of pathology，to provide some references for the clinical treatment of glucocorticoid-induced osteonecrosis.Methods Established two rats models groups，one control group with common hormone osteonecrosis and TCM treatment of glucocorticoid-induced osteonecrosis，another control group with blank.After four weeks，identified model　based on bone morphology method after the success of the confirmation from rat bone tissue protein samples，used proteomics analysis method according to the data and map for further research.Results Analyzed three groups of rats bone tissue total protein molecular anatomy atlas peptide and protein fingerprint by proteomic.There were obvious difference among three kinds of protein.Conclusion Anticoagulating Ⅱ B heavy chain of protein，lecithin glutathione oxygen enzyme and enzyme E2 ubiquitin play　important regulatory role in the incidence of glucocorticoid-induced osteonecrosis and influence the treatment results of traditional Chinese medicine treatment of glucocorticoidinduced osteonecrosis.

【Key words】 Proteomics，Hormone osteonecrosis，Traditional Chinese medicine

蛋白質組學源于蛋白質與基因組兩個詞的組合，是一種高通量篩選技術，研究的對象不僅有蛋白質的表達水平，蛋白與蛋白相互作用等，還有其他大規模水平上的蛋白質的特征 ［1］。自上世紀九十年代中提出此概念后，便成為當代生命科學的研究熱點。蛋白質在生命活動中的重要作用，決定了人們對其在醫學上的價值的期待。在本研究中，對比三組模型骨組織總蛋白質的雙向電泳圖譜，分析得到存在三種蛋白質在激素性骨壞死的發病與中藥治療中發揮著重要的調控作用。

1　資料與方法

1.1　一般資料

全部參與研究的清潔大鼠由我院飼養并提供，大鼠雄性，年齡12～14周，體重（0.2±0.04）kg。

1.2　方法

共60只清潔大鼠，隨機分組，每組各20只。激素骨壞死模型組，按照文獻方法進行為期4周的激素處理。中藥治療組將治療激素性骨壞死藥品制作成液體對大鼠灌胃，并按照模型組方法對大鼠進行4周激素處理。空白對照組的大鼠則僅注射生理鹽水。4周后通過骨骼形態學確認造模成功，分別于冰上放血處死三組大鼠，并迅速提取股骨和肱骨骨干中的骨組織蛋白質樣品。經雙向電泳分離，獲得三組骨組織總蛋白質分子解剖圖譜，并利用相關軟件分析，尋找差異蛋白質點。

1.3　觀察指標

對三組大鼠提取的骨組織總蛋白質分子的解剖圖譜、蛋白質肽指紋圖譜等差異蛋白質點進行統計、對比分析。

1.4　統計學處理

采用SPSS 13.0數據統計軟件包進行統計學處理，計量資料記作（均值±標準差），采用t檢驗，計數資料記作百分數形式，采用χ 2檢驗，用P＜0.05表示有統計學意義。

2　結果

通過對比三組大鼠骨組織總蛋白質分子的解剖圖譜和蛋白質肽指紋圖譜，發現有三種蛋白質存在明顯差異（P＜0.05），利用軟件分析，并在數據庫中搜索得知這三種蛋白質分別為阻凝蛋白重鏈ⅡB、磷脂谷胱甘肽過氧分酶及泛素化酶E2。

3　討論

組凝蛋白可以為細胞提供動力來源，其主要分布在真核生物的細胞骨架中。在組凝蛋白分子超家族中最常見的便有組凝蛋白Ⅱ，在長時間的研究中，專家已經掌握了組凝蛋白Ⅱ的分子結構、分布情況等特征。這類蛋白質廣泛存在于脊椎動物細胞中，并扮演著十分重要的角色 ［2-3］。有研究表明，同源的兩種非肌肉性阻凝蛋白Ⅱ重鏈分子，阻凝蛋白重鏈A（MHC-A）和阻凝蛋白重鏈B（MHC-B）中，有一種影響了成熟中樞神經系統神經細胞的自身活動，它就是阻凝蛋白重鏈ⅡB。本次研究中，對比模型組合中藥治療組可以發現，阻凝蛋白重鏈ⅡB有肉眼可見的缺失情況，表明其在激素性骨壞死的發病過程中特有的影響。

磷脂谷胱甘肽過氧化酶在哺乳動物胚胎期有著十分重要的地位，如果哺乳動物攝入脂質過氧化物，那么磷脂谷胱甘肽過氧化酶便發揮其降脂作用，促進脂質過氧化物的降解，以免哺乳動物因為脂質過氧化物而受到毒性傷害。除此之外，磷脂谷胱甘肽過氧化酶還具有防輻射的功能，可見磷脂谷胱甘肽過氧化酶的重要性。

泛素化酶E2的分布較之前兩種蛋白質更為廣泛，各類組織皆有，主要集中在睪丸組織中。泛素化酶E2的水解需要一定的媒介，這類介導便是糖皮質激素，糖皮質激素不僅能幫助氧化反應物相關的細胞通路，也能促進氧介導的神經毒性損害。而在本次研究的激素性骨壞死模型組中泛素化酶E2的表達十分明顯，可見糖皮質激素是激素性骨壞死發病的誘因之一。在中藥治療組的圖譜中發現泛素化酶E2大量減少，表明了中藥對激素性骨壞死的治療作用。

通過蛋白質組學研究的方法，我們初步鑒定了3種差異蛋白質點對激素性骨壞死的發病和中藥治療中的作用，為推廣其臨床應用提供了借鑒。