不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素產量的影響

胡久平，趙 輝，周禮紅，劉 敏，陳發貴，戚珊珊，熊 燕

（1.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國家地方聯合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發酵工程研究技術中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素產量的影響

胡久平1，2，3，趙 輝1，2，3*，周禮紅2，4，劉 敏1，2，3，陳發貴1，2，3，戚珊珊1，2，3，熊 燕1，2，3

（1.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國家地方聯合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發酵工程研究技術中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

研究不同物質及添加量對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的影響，并對影響蟲草菌素產量的培養基配方進行優化。結果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素分別作為碳源、氮源、無機鹽和生長因子有利于青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素的合成、累積，且作用顯著。通過正交試驗確定不同物質對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響的主次因素為蔗糖＞蠶蛹粉＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞硫酸鎂＞酵母膏，各物質最佳添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，鏈霉素2.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在優化配方條件下，青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量可達8 215 mg/kg。

青稞蛹蟲草；子實體；蟲草菌素；正交試驗

蟲草素（cordycepin）即3'-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine），又稱蟲草菌素是由蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]的培養濾液中分離得到的，蟲草菌素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素[1-2]。蟲草菌素具有多種生物活性，研究表明，蟲草菌素能特異抑制人宮頸癌細胞（Hela）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）轉錄[3]，影響Hela細胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1mRNA的表達，國產蟲草菌素可以劑量依賴方式抑制腫瘤細胞的生長，通過上調TIMP-1mRNA及蛋白的表達發揮潛在的抗腫瘤細胞侵潤轉移的作用[4]。蟲草菌素有降血糖和降血脂的作用，這為糖尿病和高脂血癥新藥開發提供了依據[5-7]。蟲草菌素還具有抗病原微生物、抗炎、抗白血病等藥理作用。近年來，國內外研究者在蛹蟲草菌株的誘變篩選和蟲草菌素的發酵條件優化方面做了大量研究[8-9]，但蟲草菌素產量依然不高。為了提高蛹蟲草固體發酵產物中蟲草菌素產量，本研究以從青藏高原分離獲得的具有高產蟲草菌素潛力的蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌株YWCM-1為試驗菌株，探討不同添加物及添加量對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的影響，以期通過添加不同物質提高青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素的含量，為青藏高原青稞蛹蟲草發酵生產蟲草菌素的產量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]菌株YWCM-1由青藏高原微生物國家地方聯合工程研究中心分離保存。青稞、蠶蛹粉：市售。

1.1.2 試劑

蟲草菌素（cordycepin）標準品：美國Sigma公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鏈霉素、檸檬酸銨、瓊脂粉、麥芽糖、酵母膏等試劑均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

菌種活化培養基采用沙氏瓊脂改良培養基：麥芽糖5 g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂粉40g，水1 000 mL，pH自然。

改良沙氏液體培養基：麥芽糖5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH自然。

發酵培養基：蛹蟲草固體發酵基質為破碎的青稞。營養液配方為葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，無水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，酵母膏5.0 g/L。基質與營養液的質量比為1∶1.5，初始pH自然，無色玻璃瓶容積為350 mL（內徑6.2 cm，高15 cm），以聚乙烯膜封口，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

1260安捷倫高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；DH-360A電熱恒溫光照培養箱：北京科偉興儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；TS-2012恒溫振蕩器：上海天呈實驗儀器制造公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；ZK-82A型真空干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和種子液的制備

菌種活化：將菌株YWCM-1接種于活化培養基上進行菌種活化，先25℃，避光培養5 d，再25℃連續光照（光強600 lx）培養1 d至菌落完全變色。

種子液制備：以50 mL無菌水洗活化后斜面上菌株孢子，制成終濃度為106個/mL的均一孢子懸液。將種子液按照體積分數5%的接種量接種于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液體培養基中，25℃、160 r/min條件下避光培養4 d，制得種子液。

1.3.2 蛹蟲草固體發酵產子實體

按照10%接種量將種子液接種于添加營養液的青稞基質上，先25℃避光培養5 d，然后連續光照2 d至菌絲完全變為橙黃色；再進行間斷光照和變溫培養（每天光照18 h，光強600 lx；光照培養溫度為25℃；避光培養6 h，培養溫度為15℃）30 d后收取子實體，用于蟲草菌素檢測，每組10個平行，結果取平均值。

1.3.3 樣品蟲草菌素測定

將收獲的子實體于60℃真空干燥，粉碎；蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量通過高效液相色譜法測定[10]。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水=5∶95（V/V），用前過0.45 μm濾膜，脫氣；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

蟲草菌素含量計算公式如下：

式中：W為蟲草菌素的含量，μg/kg；A為試樣中蟲草菌素的峰面積；As為標準工作樣中蟲草菌素峰面積；ρs為標準工作液中蟲草菌素的質量濃度，μg/mL；V為試樣液最終定容體積，mL；f為樣品稀釋倍數。

1.3.5 不同組分種類的單因素試驗

分別以葡萄糖、蔗糖、葡萄糖/蔗糖（1∶1）代替原營養液中的碳源，添加量均為20 g/L；以蛋白胨、蠶蛹粉、蛋白胨/蠶蛹粉（1∶1）代替營養液中的氮源，添加量均為10 g/L；以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀代替原營養液中的磷酸鹽，添加量均為1.0 g/L，以檸檬酸銨、鏈霉素為生長因子，添加量均為1.0 g/L，培養基質與各添加物組成的營養液的質量比均為1∶1.5，以青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素含量為評價指標，對添加物種類進行篩選，按蛹蟲草固體發酵產子實體的方法進行。

1.3.6 營養液配方優化

在單因素試驗基礎上，以青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素含量為評價指標，對蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素、酵母膏、硫酸鎂等6個因素進行優化正交試驗，每個因素選擇3個水平，按L27（36）正交表設計試驗，各因素與水平見表1。

1.3.7 統計分析方法

本研究中所有的試驗設計和數據皆采用Minitab 16.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源、磷酸鹽、生長因子的單因素試驗

以蛹蟲草固體發酵產子實體的方法，進行單因素試驗對影響青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素物質種類進行篩選，結果見圖1。

由圖1可知，不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響各不相同。在碳源方面，當以蔗糖為唯一碳源時，其子實體中的蟲草菌素含量最高，由此可知，在以青稞為發酵基質的蛹蟲草子實體發酵中蔗糖是其產蟲草菌素的最適碳源，這與MAO X B等[9，11-12]研究結果有所出入。這可能是因為本研究是以青藏高原特有的農作物青稞為發酵基質，較其他研究者所使用的大米、玉米、高粱米等發酵基質其營養成分有所差別。在氮源方面，當以蠶蛹粉為唯一氮源時蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量最高，表明蠶蛹粉是青稞蛹蟲草子實體合成累積蟲草菌素的最適氮源。在磷酸鹽方面，磷酸二氫鉀比磷酸氫二鉀更有利于蛹蟲草子實體中蟲草菌素的合成累積，這與文庭池等[13]的研究結果有所不同，可能是因為在青藏高原缺氧、干燥環境中蛹蟲草對磷酸鹽的需求有所不同。在生長因子的篩選方面，鏈霉素在子實體的蟲草菌素合成累積方面表現出了明顯優勢，這與肖正華等[14]在其他發酵基質上的研究結果一致，這表明鏈霉素為生長因子對蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積確有促進作用。

2.2 營養液配方正交試驗優化結果

單因素試驗結果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素是影響青稞蛹蟲草子實體產蟲草菌素的顯著因子，另外文庭池等[13，15]的研究表明硫酸鎂和酵母膏對蛹蟲草產蟲草菌素也有較顯著影響，因此為了確定這6因素對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響，進行正交試驗，結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

由表2可知，以青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量為評價指標，各因素對子實體中蟲草菌素含量的影響程度大小依次為蔗糖＞蠶蛹粉＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞酵母膏。最佳組合為A2B2C1D3E3F2，即添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此最佳配方條件下進行驗證試驗，蟲草菌素的含量為8 215 mg/kg。

由表3可知，蔗糖、蠶蛹粉對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積有極顯著（P＜0.01）的影響；磷酸二氫鉀和鏈霉素對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積有顯著（P＜0.05）的影響；而硫酸鎂和酵母膏對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積無顯著影響。

3 結論

本研究以青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量為評價指標對碳源、氮源、無機鹽、生長因子等進行篩選，通過單因素試驗確定有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積的碳源為蔗糖、氮源為蠶蛹粉、無機鹽為磷酸二氫鉀、生長因子為鏈霉素。篩選出的有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的物質與以往報道的有同異之處，這從一定程度上表明不同的發酵基質和發酵環境對蛹蟲草子實體中蟲草菌素的合成累積所需的物質有所影響。通過正交試驗獲得了以青稞為發酵基質有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積的最佳營養液配方為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此優化配方條件下，青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量可達8 215 mg/kg。本研究為高原環境下青稞蛹蟲草子實體產蟲草菌素的工業化開發奠定了一定基礎。

[1]林群英，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進展[J].微生物學通報，2006，33（4）：156.

[2]李祝，劉愛英，梁宗琦.蟲草菌素的生物活性及檢測方法[J].食用菌學報，2002，9（1）：57.

[3]PENMAN S,ROSBASH M,PENMAN M.Messenger and heterogeneous nuclear RNA in HeLa cells:differential inhibition by cordycepin[J].P Natl Acad Sci USA,1970,67(4):1878-1885.

[4]李婧，汪燕，馬傳榮，等.國產蟲草素（cordycepin）抗小鼠遲發型超敏反應的實驗研究[J].中國免疫性雜志，2006，22（5）：456-466.

[5]葉菲，朱海波，朱平.3′-脫氧腺苷減肥、胰島素增敏和改善脂代謝的用途.中國，CN200810106024.X.[P].2008.

[6]GUO P,KAI Q,GAO J,et al.Cordycepin prevents hyperlipidemia in hamsters fed a high-fat diet via activation of AMP-activated protein kinase[J].J Pharmacol Sci,2010,113(4):395-403.

[7]朱平，朱海波，朱慧新，等.3′-脫氧腺苷在制備降血脂藥物中的應用.中國，ZL200310101650.7[P].2003.

[8]XIE C Y,LIU G X,GU Z X,et al.Effect of culture conditions on mycelium biomass and intracellular cordycepein production ofCordyceps militarisin natural medium[J].Ann Microbiol,2009,59(2):293-299.

[9]MAO X B,EKSRIWONG T,CHAUVATCHARIN S,et al.Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by subermerged cultication of medicinal mushroomCordyceps militaris[J]. Process Biochem,2005,40(5):1667-1672.

[10]農業部食用菌產品質量監督檢驗測試中心.NY/T 2116—2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法[S].北京：中國標準出版社，2012.

[11]韋會平，葉小莉，張華英，等.用蛹蟲草固體發酵法高效生產蟲草素的研究[J].中國中藥雜志，2008，33（19）：2159-2162.

[12]樂昕，袁蜜，支月娥，等.栽培基質及碳源對蛹蟲草子實體中主要成分的影響[J].食品科技，2014，39（2）：2-7.

[13]文庭池，康冀川，梁宗琦，等.蛹蟲草高產菌絲體和蟲草菌素的深層培養工藝優化[J].貴州科學，2013，31（5）：5-15.

[14]肖正華，李再新，李建章，等.添加劑對蛹蟲草子實體生長分化影響的研究[J].食品與發酵科技，2010，46（3）：60-64.

[15]施渺筱，舒星，肖洋，等.正交實驗優化蛹蟲草培養基成分提高蟲草菌素含量[J].時珍國醫國藥，2009，20（9）：2221-2222.

Effect of different additives on the production of cordycepin in the fruit body of highland barleyCordycepes militaris

HU Jiuping1,2,3,ZHAO Hui1,2,3*,ZHOU Lihong2,4,LIU Min1,2,3,CHEN Fagui1,2,3,QI Shanshan1,2,3,XIONG Yan1,2,3
(1.Tibet Yuewang Biotechnology Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China; 2.National United Engineering Research Center for Tibetan Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 3.Lhasa Highland Barley Fermentation Engineering Technology Research Center,Lhasa 850000,China; 4.Institute of Fungi Resource,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The effect of different additives and additions on cordycepin content of highland barelyCordycepes militarisfruit body was studied,and the medium formula that affect cordycepin production was optimized.Results indicated that sucrose,silkworm chrysalis meal,monopotassium phosphate and streptomycin were the optimal carbon source,nitrogen source,inorganic salt,and growth factor,respectively,which are all significantly beneficial to cordycepin sythesis and accumulation.The orthogonal experiments indicated that the effect of different substances on cordycepin content in order was sucrose,silkworm chrysalis meal,potassium dihydrogen phosphate,streptomycin,magnesium sulfate,yeast extract,respectively.The optimal addition were sucrose 30 g/L,silkworm chrysalis meal 7.5 g/L,monopotassium phosphate 1.0 g/L,streptomycin 2.0 g/L,magnesium sulfate 1.5 g/L and yeast extract 2.5 g/L,respectively.The cordycepin production in highland barelyC.militarisfruit body could reach 8 215 mg/kg at such condition.

highland barleyCordycepes militaris;fruit body;cordycepin;orthogonal experiment

Q815

A

0254-5071（2015）06-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.018

2015-05-27

拉薩市科技計劃項目（201410）

胡久平（1986-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程、微生物活性。

*通訊作者：趙輝（1969-），男，經濟師，碩士，研究方向為發酵工程、工商行政管理。