長枝木霉原生質體制備及再生條件研究

丁 蘇，李 獻，李 瑋，畢方方，林 玲，韋俏娜，張 瑛

（1.廣西大學行健文理學院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

長枝木霉原生質體制備及再生條件研究

丁 蘇1，李 獻1，李 瑋2，畢方方1，林 玲2，韋俏娜1，張 瑛2*

（1.廣西大學行健文理學院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

研究優化了長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15菌株菌絲體制備原生質體細胞及再生的條件。通過單因素試驗和正交試驗對影響原生質體形成和再生的菌齡、破壁酶組成、酶解反應溫度及時間、滲透壓穩定劑等因素進行了篩選優化。結果表明，長枝木霉菌株JK-15的最適條件為菌絲體菌齡18 h，混合酶組成配比為1.5%蝸牛酶∶1.5%纖維素酶∶0.1%溶壁酶，酶解條件為30℃條件下酶解2.5 h，原生質體制備過程中滲透壓穩定劑為0.7 mol/L山梨醇，原生質體再生培養基中滲透壓穩定劑為0.7 mol/L蔗糖，實驗結果為長枝木霉JK-15的育種工作奠定了良好的技術基礎。

長枝木霉；原生質體；生物防治；育種

木霉（Trichodermaspp.）是一類具有較強生物防治功效的絲狀真菌，其具有生長迅速、能分泌多種抑菌物質、能夠對植物病原菌進行重寄生等生理特性，因而在國內外被廣泛的用于多種植物病害的生物防治研究[1-3]。但在實際的農業生產應用過程中，大多數木霉菌均會表現出最適溫度區間較小、定殖能力不穩定、抑菌廣譜性較差等不足。為了解決這些問題，研究人員一方面不斷努力從自然界中篩選更優良的野生菌株，另一方面也在嘗試通過微生物育種的方法改良現有菌株[4-7]。通過制備木霉的原生質體，進而進行誘變或融合，是對木霉菌株進行改良選育的有效手段[8-9]。

目前國內外關于長枝木霉原生質體制備的方法報道較少，在前期研究中，本課題組從自然環境中篩選獲得了對葡萄灰霉病和潰瘍病具有較好生物防治效果的野生長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，但因其表現出對高溫耐受較差的缺點，不利于在廣西等我國南部地區的實際應用，因此，本研究通過原生質體育種的方法，對該菌進行改良，對長枝木霉JK-15的原生質體制備及再生條件進行研究，為今后的原生質體育種工作奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，由廣西農業科學院葡萄與葡萄酒研究所篩選并保藏。

1.1.2 培養基

斜面及平板培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

菌絲體培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，MgSO45 g，KH2PO45 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

1.1.3試劑及溶液

蝸牛酶（10 U/mg）：福建漳州金田生物科技有限公司；纖維素酶（CAS9012-54-8，10U/mg）、β-巰基乙醇（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；溶壁酶（CAS158928，10000U/mL）：德國Qiagen公司；NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（0.2mol/L，pH5.7）的配制：NaH2PO42.917g，Na2HPO40.466g，去離子水100 mL。

滲透壓穩定液：用PBS緩沖液分別配制0.7mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇的滲透壓穩定液。

菌絲前處理液：含體積分數0.1%β-巰基乙醇的20 mmol/L EDTA溶液。

酶溶液：用滲透壓穩定液配制蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶的單一組分酶溶液或混合酶溶液，于常溫下令酶粉或酶液充分混勻后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm無菌微孔過濾器過濾除菌。

1.2 儀器與設備

EBA21型高速離心機：德國Hettich Zentrifugen公司；J2-21高速冷凍離心機：美國Bechman公司；ILB-008-04低溫恒溫循環器：施都凱儀器（上海）有限公司；SPX-250型生化培養箱：上海躍進醫療儀器廠；HVE-50自動滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SKY-211B振蕩培養箱：上海蘇坤儀器設備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；OLYMPUS CX41光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保藏的長枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105個/mL的單孢子懸浮液，稀釋涂布于PDA平板上，30℃培養36 h，挑取生長迅速、表面長滿綠色孢子的單菌落接種于PDA斜面上，30℃培養3 d，至斜面培養基表面長滿。

1.3.2 菌絲體的培養

將活化培養獲得的長枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105CFU/mL的單孢子懸浮液，按10%（V/V）的接種量接種于盛有100 mL菌絲體培養基的500 mL三角瓶中，160 r/min振蕩培養適宜的時間后，用4層擦鏡紙過濾收集菌絲體用于制備原生質體。

1.3.3 原生質體的制備與再生

將收集的菌絲體用PBS緩沖液和無菌水依次洗滌3次，重懸浮于菌絲前處理液中，處理一定時間后，用滲透壓穩定液洗滌3次，收集菌絲體重懸浮于酶液中，于100 r/min振蕩酶解制備原生質體。酶解結束后用4層擦鏡紙過濾，收集濾液，4 000 r/min離心10 min，收集原生質體沉淀，重懸浮于滲透壓穩定液中，用血球計數板進行計數，隨后用滲透壓穩定液進行梯度稀釋涂布于高滲平板（在普通平板中添加滲透壓穩定劑）和普通平板上，于30℃培養72 h，統計平板上單菌落數量，用以下公式計算原生質體再生率：

式中：A為高滲平板上生長的單菌落數，CFU/mL；B為普通平板上生長的單菌落數，CFU/mL；C為顯微鏡下觀察到的原生質體數，CFU/mL。

2 結果與分析

2.1 破壁酶液組分優化

由于不同微生物的細胞壁組成結構差異較大，因而在制備原生質體時所選擇的破壁酶的種類、用量及配比也隨之存在較大差別[10-13]，需要根據實際情況進行選擇優化。本實驗中選擇制備絲狀真菌原生質體常用的蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶配制混合酶液，以原生質體生成量作為考察指標，通過正交試驗確定最適的組合條件。正交試驗結果及分析見表1，方差分析見表2。

由表1可知，混合酶3個組分對長枝木霉原生質體制備影響大小順序為纖維素酶＞溶壁酶＞蝸牛酶，最優化混合酶配比為A3B3C1，即1.5%蝸牛酶，1.5%纖維素酶，0.1%溶壁酶。驗證試驗結果表明，該配比條件下酶解生成原生質體的數量為（9.8±0.2）×106CFU/mL。

由表2可知，蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶對原生質體生成量影響均顯著（P＜0.05）。

在此基礎上，同時選擇了4組生成原生質體效果最優的酶組合，考察其制備所得原生質體的再生率，結果如圖1所示。由圖1可知，A3B3C1混合酶配比條件下，既能獲得較高的原生質體制備效率，又能保持較好的再生率，因而將A3B3C1混合酶配比確定為后續工作的混合酶配比方案。

2.2 菌絲體培養時間的確定

菌絲體的菌齡對于細胞壁結構、原生質體的生成效率及活力影響顯著。菌齡過長易造成細胞壁結構變厚不得于原生質體的釋放；菌齡過短菌絲易斷裂，不利于原生質體與菌絲體的分離。絲狀真菌往往選擇處于生長旺盛期的細嫩菌絲用于制備原生質體。由圖2A可知，原生質體的生成數量隨菌絲體菌齡而增加，至菌齡達到18 h后原生質體的生成量開始下降；由圖2B可知，菌齡18 h的菌絲體制備得到的原生質體再生率也最高。因此，選擇18 h為長枝木霉JK-15制備原生質體的最適菌齡。

2.3 最適酶解溫度與時間的確定

不同酶解溫度及酶解時間條件下原生質體生成曲線如圖3所示。過高或過低的酶解溫度會影響原生質體的生成速度和最終的制備效率；而原生質體的生成量與酶解的反應時間呈正比，但過長的反應時間會使已生成的原生質體細胞被破壞死亡，從而降低制備效率。由圖3可知，，長枝木霉JK-15原生質體酶解的最適溫度為30℃，最適酶解反應時間為2.5～3.0 h。在此基礎上，分別測定了30℃酶解2.5 h、3.0 h、3.5 h制備所得原生質體的再生率，分別為19.6%、16.7%和12.3%，綜合考慮原生質體的生成量和再生率，確定在30℃下酶解2.5 h為酶解反應的最適條件。

2.4 滲透壓穩定劑對于原生質體制備與再生的影響

滲透壓穩定劑的作用是維持原生質體正常形態[14-15]，其不僅影響原生質體的制備效率，同時影響原生質體的再生率。不同微生物在制備原生質體過程中，適宜的滲透壓穩定劑差異較大，需要通過試驗進行篩選。本研究添加0.7 mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透壓穩定液，分別考察其對原生質體生成量及再生率的影響，結果見圖4。由圖4可知，對于原生質體制備和再生效果最好的穩定劑分別為山梨醇和蔗糖，因此在制備原生質體時應使用0.7 mol/L山梨醇為穩定劑，而在再生培養基中應使用0.7 mol/L蔗糖作為穩定劑。

3 結論

原生質體的制備與再生是微生物原生質體融合、原生質體誘變以及基因組重組等育種過程中的關鍵性環節。能夠在高效制備原生質體的前提下實現較高的原生質體再生率對于育種工作的效率與結果至關重要。本研究通過一系列的條件優化，最終確定了長枝木霉JK-15最適的原生質體制備及再生條件為：菌絲體菌齡18 h；混合酶組成配比為1.5%蝸牛酶：1.5%纖維素酶：0.1%溶壁酶；酶解溫度30℃，酶解時間2.5 h；原生質體制備過程中滲透壓穩定劑為0.7 mol/L山梨醇，原生質體再生培養基中滲透壓穩定劑為0.7 mol/L蔗糖。本研究的結果為長枝木霉JK-15的育種工作奠定了良好的技術基礎，同時為其他長枝木霉菌株原生質體的制備工作提供了參考。

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Optimization ofTrichoderma longibrachiatumprotoplasts preparation and regeneration conditions

DING Su1,LI Xian1,LI Wei2,BI Fangfang1,LIN ling2,WEI Qiaona1,ZHANG Ying2*
(1.Xingjian College of Science and Liberal Arts,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)

The protoplasts preparation and regeneration conditions ofTrichoderma longibrachiatumJK-15 were studied.The effect of mycelia growth time,enzyme composition,enzymatic reaction temperature and time,osmotic pressure stabilizer on protoplasts formation and regeneration were optimized by single factor experiments and orthogonal experiments.The results showed the optimal conditions were mycelia growth time 18 h,enzyme composition snailase 1.5%,cellulose 1.5%and lytic enzyme 0.1%;enzymatic reaction was carried out at 30℃for 2.5 h,the optimal osmotic pressure stabilizers in protoplast preparation process and protoplast regeneration process were sorbitol 0.7 mol/L and sucrose 0.7 mol/L,respectively.The research has laid a good working basis for further breeding ofT.longibrachiatumJK-15.

Trichoderma longibrachiatum;protoplast;biological control;breeding

Q939.96

A

0254-5071（2015）06-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.013

2015-05-20

廣西自然科學基金（2014GXNSFAA118107）；廣西大學行建文理學院科研基金（2013ZKLX03）

丁蘇（1985-），女，講師，碩士，研究方向為微生物工程。

*通訊作者：張瑛（1974-），女，研究員，碩士，研究方向為葡萄育種及病蟲害防治。