干酪微觀結構觀察方法與研究進展

朱軍偉，杭鋒，王欽博，穆海菠，郭本恒

（光明乳業股份有限公司，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436）

0 引言

干酪是一款功能多樣、營養豐富的乳制品，可以作為主食、甜品、零食、調味品，或者是作為其他食品的一種組分，現有品種已經超過500種。這類乳制品是蛋白質、維生素和礦物質（特別是鈣和磷）的良好來源。因此，干酪成品品質的評價極其重要，主要包括風味、理化和功能特性（質構和熔化特性），對于這些功能性的預測及控制需要理解不同功能組分的定位以及他們之間的相互作用，這就需要我們研究生產和貯藏過程中干酪微觀結構的變化[1,2]。干酪微觀結構的常規檢測方法有光學顯微鏡(LM)，共聚焦激光掃描顯微鏡(CSLM)，電子顯微鏡（EM）如掃描電鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）[3,4]等技術。與LM和CSLM技術相比，EM技術的主要優點是可以獲得干酪組分分辨率更高的成像，也是目前應用最為廣泛的微觀分析技術。本文綜述了利用顯微鏡技術研究干酪微觀結構的觀察方法與最新進展，旨在為該方向研究提供借鑒。

1 研究方法

1.1 光學顯微鏡技術（LM）

光學顯微鏡（LM）技術在干酪微觀結構分析中常被用來快速獲取定量和定性的信息[5]，這是LM技術的主要優點。傳統的LM技術包括明視野、偏振光、熒光和共聚焦顯微鏡技術。在干酪微觀結構分析中，共聚焦顯微鏡技術最常被用到。然而，光學顯微鏡技術在對干酪樣品做前處理時，勢必會用到各類染色劑，這也極有可能導致一些假象的產生；另外，在干酪受到冷凍、加熱或冷卻時，也會對微觀結構產生一定的影響，這也是光學顯微鏡技術最大的缺點。

1.1.1 明視野顯微鏡技術

在鏡檢前需對干酪樣品進行前處理工作，樣品須被切分成5 μm厚度。為使樣品具有剛性便于切片，可以使用酒精脫水后的樹脂對樣品進行包埋，也可以直接將樣品冷凍。利用第一種方法對樣品包埋后，再用玻璃超薄切片機分段[6]。目前，干酪微觀結構分析中常用到的前處理方法是冷凍切片。小的長方形樣品用冷凍保護劑（如最佳切割溫度復合物OCT）包埋后，置于液氮冷凍。之后，樣品在-30℃冷凍切片機中被切片[1,2,7-8]。這兩種方法獲得切片后，需用甲醛或戊二醛進行固定，固定好的切片再對脂質、蛋白質及其他組分如淀粉、碳水化合物等進行染色。

特異性染色劑可以用來鑒定干酪體系中蛋白質、脂肪和碳水化合物等組分。蛋白質的染色劑最常用的是固綠、丫啶橙和亞甲基藍，而脂肪染色劑常用的則是油紅O和蘇丹紅。碘常和蛋白質與脂肪染色劑結合起來使用來鑒定淀粉等碳水化合物[9]。

1.1.2 偏振光顯微鏡技術

在偏振光顯微鏡技術分析干酪微觀結構中，干酪樣品的前處理方法和明視野顯微鏡技術基本一致。偏振光顯微鏡技術用于檢測具有雙折射結構的食品組分，如有序的結晶結構。當偏振光通過雙折射材料時，光線會在不同的平面和軌道上以不同的速度振動[10]。雙折射材料在黑暗的背景下會很明亮或是呈現一定的顏色。

許多干酪組分都是雙折射結構，如脂肪和碳水化合物[1,2]。在偏振光顯微鏡下觀察成品干酪樣品，可以分析其淀粉是否已經糊化。干酪淀粉在未糊化狀態下并不會呈現雙折射結構，因此無法成像，但是當干酪經微波加熱后，淀粉糊化，此時可在偏振光顯微鏡下觀察到雙折射結構[11]。與明視野顯微鏡技術相比，偏振光顯微鏡技術的優點是無需對樣品染色，但是此技術有很大局限性，僅能檢測分析干酪組分中的雙折射結構。

1.1.3 熒光顯微鏡技術

熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光（如紫外光λ=3650或紫藍光λ=4200）作為激發光、激發樣品內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。熒光具有專一性，一般都比激發光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現出專一的熒光色彩[12]。

在干酪微觀結構分析中使用熒光顯微鏡技術同樣需要對樣品進行前處理，這也是這種方法的主要缺陷。與其他顯微鏡技術相比，熒光顯微鏡技術的靈敏度更高，最小可以檢測10-18mol的熒光化合物[13]。熒光大多來源于特異性化學染料，但也必須在特定的化學環境中進行染色。例如，尼羅紅（脂溶性染料）和尼羅藍（水溶性染料）在疏水性介質中遇到干酪中的脂肪球和蛋白質時會在極短時間內分別發射出較照射波長更長的可見熒光[14]，因而可以鑒別脂肪和蛋白質的分布。現如今，由于熒光染色技術已經廣泛應用于共聚焦顯微鏡分析技術中，因此熒光顯微鏡技術在干酪微觀結構分析中并不常用。

1.1.4 共聚焦激光掃描顯微鏡技術

共聚焦激光掃描顯微鏡技術（CSLM）是研究分析乳制品尤其是干酪微觀結構中最常用的顯微鏡技術之一[15-16]。由于激光掃描能穿透干酪表面使得光學薄片可視化，從而在不打亂內部結構的情況下對干酪微觀結構進行三維立體分析。與LM技術相比，CSLM不必對干酪樣品進行切分前處理，因此可以避免產生一些假象。然而，CSLM技術的缺點是設備購買和維護費用極高[12]。

標準的CSLM裝備有氬離子激光或氦氖離子激光發射器，其所拍攝到的圖像的清晰度可以達到幾百微米。Ong等[4]利用CSLM技術還原了切達干酪的三維結構圖，使得分析更為具體和形象。據報道[17,18,19]，利用特異性的熒光或者染料可以鑒定一些干酪組分如蛋白質和脂肪，還可以定位一些微生物的位置。干酪微觀結構分析中最常用的熒光染料為固綠、若丹明和異硫氰酸熒光素（蛋白質），油紅O和尼羅紅（脂肪）[20]。

1.2 電子顯微鏡技術（EM）[1,2,4,7-8]

與光學顯微鏡相比，電子顯微鏡的分辨率可以達到0.1～5 nm，因此，當需要獲取高分辨率圖像時，通常使用電子顯微鏡技術，如為了分析干酪中蛋白質的精細結構時。目前在干酪微觀結構分析中常用的電子顯微鏡技術為掃描電子顯微鏡技術（SEM），某些時候也會用到透射電子顯微鏡技術（TEM）。這兩種方法的不同點在于樣品的前處理，這也導致了他們所應用的范圍不同。

1.2.1 掃描電子顯微鏡技術（SEM）

1.2.1.1 傳統SEM

電子槍產生的電子束與物質相互作用后發射出大量放射性物質（二次電子），通過對二次電子的采集可以得到有關物質微觀形貌的信息[21]。此項技術必須在真空環境下進行，且樣品必須徹底干燥，這樣才能產生樣品微觀結構信息的清晰圖像。為了能夠收集到更多的二次電子，有必要在樣品表明涂上一層導電層來防止發生充電現象。

掃描電鏡技術應用于干酪微觀結構分析已經有很長一段時間了。一束高能的入射電子轟擊干酪表面時，被激發區域產生的大量二次電子，再通過檢測器收集，最后生成結構圖像。干酪在進行SEM分析前需對樣品做以下前處理[22]。利用刀片將干酪切分為矩形狀，然后分別用戊二醛溶液固定、酒精梯度脫水、氯仿脫脂。接著在液氮中冷凍斷裂，最后用液態二氧化碳臨界點干燥儀干燥。干燥后的切片樣品固定在操作臺，用離子濺射儀在樣品表面鍍一層20～30 nm的金膜。如果重點觀察脂肪變化，則在使用戊二醛固定前，先用四氧化鋨咪唑緩沖液固定，且無需進行脫脂操作。此外，樣品制備需在低溫下進行以防止破壞脂肪球。然而在樣品制備時所用到的酒精和冷凍操作，會對干酪的結構造成輕微的損傷或斷裂，這也是SEM主要的一大缺點[23]。干酪微觀結構最新研究報道中，關注的重點在細菌細胞組分而不是脂肪，因此酒精梯度脫水成為研究熱點[16,24]。這一步可以在不打斷重疊脂肪球的情況下，幫助定位干酪結構中的細菌細胞所處位置。樣品制備完成后，在5～15 V加速電壓及500～10 000放大倍數下，立即進行掃描電鏡觀察。

1.2.1.2 冷凍SEM（cryo-SEM）

常規掃描電鏡要求所觀察的樣品無水，而一些樣品在干燥過程中會發生結構變化，致使無法觀察其真實結構，冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM)就是在傳統的SEM基礎上增加一個冷凍臺，這樣可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的乳制品的微觀結構，如酸奶、冰淇淋以及絕大多數干酪[25]。

這項技術整個樣品檢測過程溫度必須控制在-80℃以下。由于低溫掃描電子顯微鏡簡化了樣品制備過程且降低了電鏡級化學品的消耗，這項技術已經應用于干酪微觀結構的檢測分析研究中。例如，cryo-SEM更適用于分析全脂干酪，尤其是脂肪組分容易在脫水或脫脂過程中發生變化的干酪。然而，據報道[1]，成品干酪cryo-SEM分析過程中的低溫有可能會導致干酪收縮，進而影響到蛋白質的結構成像。

近來，cryo-SEM已被廣泛應用于成品切達干酪的微觀結構分析研究中。簡要的過程如下。1 mm×3 mm×5 mm的干酪塊置于載物臺上迅速置于液氮中（-210℃）冷凍固定。樣品隨即轉移到-180℃真空冷凍室中，待樣品表面斷裂后，用離子濺射儀在樣品表面鍍一層20～30 nm的金膜，使其具備一定的導電性，最后在顯微鏡下以5～15 V加速電壓及500～10 000放大倍數下，立即進行掃描電鏡觀察。從獲取的電鏡圖像可以鑒別淀粉顆粒，因為這些顆粒大都為球形且與蛋白質相分離，比脂肪球尺寸更大[2,16]。

1.2.1.3 環境SEM（ESEM）

ESEM與傳統SEM不同點在于ESEM在微觀結構觀察時需要提供一個氣態環境。傳統SEM需要在真空環境下完成檢測，而ESEM的優點在于樣品可以在一個相對較高的壓力環境下檢測，而且不需要樣品完全干燥[26]。這意味著如果水蒸汽是樣品室中使用的氣體，那么含水的樣品在必要的前處理后不需要再做其他改變就可以在其原生狀態下成像。ESEM還有一個優點是樣品不受超低溫影響，因而高分辨率顯微鏡技術不會受到消極影響。

目前，ESEM技術已被用于一些干酪微觀結構的研究中。從天然干酪的顯微照片中可以觀察到其結構緊湊、粗糙，結構間有非常微小的間隙[27]。成品干酪中，Noronha等[1]發現利用cryo-SEM和ESEM所得到的微觀結構存在一定的差異，并解釋了產生差異的原因在于樣品前處理的要求不一樣。ESEM顯微照片顯示蛋白質基質呈多孔狀，而cryo-SEM的顯微照片中蛋白質基質表面是平滑的。然而，與cryo-SEM相比，ESEM在鑒別淀粉和脂肪球結構方面沒有太大的用處，這也是ESEM技術在干酪微觀結構分析中的一大缺陷。

1.2.2 透射電子顯微鏡技術（TEM）

透射電子顯微鏡技術基本原理是電子束穿過樣品室內樣品時會攜帶有樣品的內部結構信息，TEM的成像設備使用這些信息來成像。因此，為了獲得分辨率較高的電子顯微圖像，樣品厚度必須非常薄（0.1～0.2）[28]，在制備干酪樣品時就必須使用到薄切片技術。

Reis等[29]為了能夠利用薄切片技術，將大約1 mm×1 mm×1 mm大小的干酪先用化學試劑進行包埋和固定（此步驟與傳統SEM基本一致），后再用超薄切片機將樣品切分到0.1～0.2 μm，最后將薄切片置于銅載網上用2%醋酸雙氧鈾溶液和檸檬酸鉛染色，但是在進行顯微觀察時必須使用更高的加速電壓（50～70 kV）。

利用TEM技術分析干酪微觀結構的主要優點在于它能獲得比其他顯微鏡技術更高分辨率的圖像，這將有利于應用圖像處理軟件做進一步分析，因而所獲取的結果具有更高的準確性和一致性[29]。然而，TEM技術也有一些劣勢限制其廣泛應用，如易產生假象、樣品制備復雜、耗時且耗費高[30]。

1.3 其他顯微鏡技術

國內外有一部分學者為了獲取礦物質如鈣、磷、鈉和鉀等在干酪中的分布，將顯微鏡技術與其他分析技術結合起來做了一些研究。如能量過濾透射電鏡技術（Energy Filtered Transmission Electron Microscopy，EFTEM）[31]，能量過濾器的使用可以提高能量分辨率，對于微區內元素的分布等分析更加精確，它是研究干酪礦物質在顯微結構中分布的有用手段，也是目前國內外研究的一大熱點。最近，傅里葉變換紅外成像技術（FTIR）也被用來分析干酪微觀結構[1]。此法獲得的圖像對于干酪中蛋白質、脂肪和淀粉的分布提供了很有價值的信息。但是，作者并沒有對干酪做進一步關于定量的研究。

2 結論與展望

本文綜述了干酪微觀結構的研究分析方法及研究進展，主要包括光學顯微鏡技術和電子顯微鏡技術，并比較和闡述了各自方法的優缺點和相關操作流程，希望能給干酪微觀結構研究的工作者提供一些理論支持，進而結合實際找到適合自己研究的顯微鏡技術。干酪微觀結構的研究，未來可以從以下幾方面著手開展。

首先，有必要對于干酪微觀結構中礦物質元素的分布做更為系統的研究，如運用LM和CSLM技術，還有EFTEM技術，從而建立一套完整且系統的礦物質元素分布的研究方法。

其次，細菌在干酪中的分布及其對干酪品質的影響已經成為當下的研究熱點。如何在干酪樣品制備過程中最大程度減小對細菌的破壞，成為這類研究的關鍵。

最后，還應該將這些研究方法所得到的結果與干酪不同成熟階段所表現的現象聯系起來，從而更加科學的解釋其功能性質。

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