豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進展

劉燦，寧宜寶，徐鑌蕊

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京100193）

豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進展

劉燦1，2，寧宜寶1?，徐鑌蕊2?

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京100193）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的嚴重危害世界養豬業的一種傳染病，該病可造成豬的繁殖障礙、呼吸系統病癥與生長受阻。本文著眼于PRRSV疫苗的免疫原性、保護效力和安全性，涉及市場上現有的商品化疫苗與已報道的處于試驗階段的相關疫苗研究成果，以期為PRRSV的防控與疫苗研發提供有益的參考。

豬繁殖與呼吸綜合征；疫苗；疫病防控

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的重大動物傳染性疾病［1］。從1980年代末在北美被發現至今，該病在世界范圍內的流行與數次暴發導致了世界各地養豬業的巨大經濟損失。PRRSV屬于動脈炎病毒科，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為15 kb，包含至少10個開放閱讀框（ORF），依據基因特征分為北美型與歐洲型兩個亞型，兩型之間的同源性大約為60%［2-4］，并且兩種亞型的PRRSV基因序列的進化率的變異率（10-2／位／年）明顯高于其它RNA病毒（10-3～-5／位／年），由此帶來了更為復雜的疫苗研發難題［5］。

常用的PRRSV疫苗包含滅活疫苗與弱毒疫苗，滅活疫苗的安全性與弱毒疫苗更為優秀的臨床效果是兩者各自的突出優點，同時滅活疫苗的交叉保護性差和弱毒疫苗的毒力返強與基因重組風險也制約著世界范圍內養豬業對PRRSV的防控與將來的凈化。此外，日趨成為研究熱點的多種基因工程疫苗也逐漸為畜牧獸醫從業人員所熟知［6-8］。筆者就目前市場上現有商品化疫苗與國內外疫苗研究進展作一綜述。

1 滅活疫苗

PRRSV滅活疫苗具有安全、不返強、不干擾母源抗體和易貯存與運輸等優點，其缺點則為單次免疫劑量大，需多次免疫且對異源毒株免疫效果不理想?，F有商品化的滅活疫苗在歐洲市場得到了大量應用，包括應用于母豬與仔豬的德國勃林格公司的Ingelvac?PRRS（P120株）疫苗、西班牙海博萊公司的Suipravac-PRRS（5710株）疫苗、法國梅里亞公司的Progressis?疫苗，以及可同時應用于種公豬、母豬與仔豬的捷克Dyntec公司的Suivac PRRS-IN（VD-E1／E2與VD-A1株）疫苗；在美國市場則僅短暫出現過荷蘭英特威公司的PRRomiSeTM疫苗；亞洲市場的韓國主要使用其本土企業生產的SuiShot?PRRS疫苗，中國常見的PRRSV滅活疫苗除了幾個歐洲品牌之外，還有山東齊魯生產的PRRSV-SD1滅活疫苗、中牧與廣東永順生產的NVDC-JXA1株滅活疫苗。

Dai等［9］將仙臺病毒的包膜蛋白（HVJ-E）作為免疫佐劑加入JXA1-R作為毒種產生的滅活疫苗比無佐劑的滅活疫苗對28日齡仔豬的免疫保護效果更好：HVJ-E為佐劑的滅活疫苗比無佐劑滅活疫苗誘導了更強的淋巴細胞增殖效果、γ干擾素與白介素2（IL-2）上調、白介素10（IL-10）下調以及更高的抗體水平，攻毒后的臨床觀察表明含HVJ-E佐劑的滅活疫苗能更大程度地減輕仔豬的臨床癥狀。Geldhof等［10］比較了三種歐洲的商品化疫苗和以07V063株、LV株為毒種的兩種自制滅活疫苗對抗07V063野毒株時對仔豬的免疫保護效果，發現三種商品化疫苗比兩種對照組都可將病毒血癥縮短至少1星期，而兩種自制滅活疫苗都沒有影響病毒血癥的持續時間。有趣的是：相較于三種商品化的滅活疫苗與弱毒疫苗，兩種自制滅活疫苗誘導動物機體產生了針對07V063的中和抗體。然后，Geldhof等又做了第二個試驗，比較了08V194株、LV株與07V064株為毒種的滅活疫苗與商品化弱毒疫苗Porcilis?PRRS對抗08V194野毒株的免疫保護效果，發現LV株、07V064株為毒種的滅活疫苗對病毒血癥持續時間無明顯影響，針對08V194株的特異性中和抗體在所有免疫的動物體中都有檢測到，其中弱毒疫苗誘導機體產生中和抗體的速度更快。綜合上述兩個試驗結果分析，提示當田間流行的變異毒株躲避了現有弱毒疫苗提供的免疫之后，同型的滅活疫苗或許能提供一定的保護。Karniychuk等［11］同樣利用PRRSV-07V063株為毒種制備滅活疫苗，在懷孕母豬孕期的第27天、55天與83天依次進行了三次免疫，然后在第90天使用07V063株進行攻毒，結果表明該滅活疫苗不能對母豬與胎豬提供完全保護，但能夠輕微地減弱母豬的病毒血癥，其中值得注意的是，它能通過減少PRRSV從子宮內膜轉移到胎盤的數量以提高胎豬的成活率。Dwivedi等［12］應用可生物降解的納米顆粒聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly（D，Llactideco-glycolide），PLGA）包裹的VR2332毒株滅活疫苗滴鼻免疫3到4周齡仔豬后的第21天進行攻毒，發現經納米顆粒滅活疫苗免疫的仔豬的病毒血癥持續時間縮短到兩周，肺臟勻漿中γ干擾素上調，轉化生長因子-β下調，且肺臟勻漿做中和試驗的滴度明顯高于對照組與普通滅活疫苗組，表明納米顆粒PLGA包裹滅活疫苗以滴鼻途徑免疫仔豬可以作為有效的免疫途徑快速清除病毒血癥并對抗PRRSV感染。

2 弱毒疫苗

目前，PRRSV弱毒疫苗在田間應用最為廣泛，相較于滅活疫苗具有免疫力強、抗體產生速度快、可體內復制并保持長久免疫效力等優點。1995年，德國勃林格公司開發出首個商品化的用于3到15周齡豬的北美型PRRSV弱毒疫苗Ingelvac?PRRSV MLV（VR-2332株，2005年進入中國市場），該公司后期又研發出應用于仔豬與育肥豬的北美型PRRSV弱毒疫苗Ingelvac?PRRS ATP（JA-142株）。僅應用于歐洲市場的歐洲型PRRSV弱毒疫苗包括美國默克公司的應用于母豬與后備母豬的Porcilis PRRS?（DV株）弱毒疫苗、西班牙海博萊公司的應用于仔豬與育肥豬的Amervac-PRRS?（VP046株）弱毒疫苗與西班牙Syva公司的應用于各階段豬只的Pyrsvac-183?（All-183株）弱毒疫苗。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所以本土分離毒株CH-1a株為種毒研制的CH-1R弱毒疫苗于2007年正式投產上市。2008年，中國動物疫控中心、哈爾濱獸醫研究所與特產研究所分別研制出針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的弱毒疫苗JXA1-R株、HUN4-F112株與TJM-F92株，免疫這三種弱毒疫苗的仔豬能很好地抵抗同源與異源毒株的感染［13-15］。2009年，南京農業大學與天津瑞普公司共同研發的R98株弱毒疫苗也被批準為新獸藥［16］。中國獸醫藥品監察所將HP-PRRSV GD株在體外傳代致弱，獲得GDr180弱毒株在臨床試驗中表現出優良的免疫效果與安全特性。

Martelli等［17］將Porcilis PRRS?（DV株，歐洲型）弱毒疫苗分別采用肌肉注射與無針頭注射器皮內注射的方式免疫了4周齡仔豬，在免疫后第45天將免疫豬與對照豬一起跟有PRRSV感染史（該養殖場內流行PRRSV毒株為歐洲型意大利亞群，與弱毒疫苗DV株同源性為84%）的常規田間飼養的仔豬并圈飼養，觀察發現免疫仔豬比對照組仔豬的臨床癥狀減輕了68%～72%，呼吸系統癥狀減輕了72%～80%，臨床保護效果與顯著升高的細胞免疫反應密切相關，表明以兩種不同方式注射該疫苗都可有效抵抗同源性為84%的異源毒株的感染。此外試驗提示在影響疫苗保護效果的因素中，疫苗株誘導細胞免疫的強弱能力比其與田間流行毒株的同源關系遠近更重要。Linhares等［18］為了研究弱毒疫苗在田間臨床應用時對感染／帶毒豬只體內PRRSV病毒的清除能力，設計試驗將2000頭3周齡仔豬等分到兩個獨立的豬舍，待仔豬飼養至8周齡時，從兩個豬舍中各取100頭進行野毒（與北美型MN184毒株同亞群的毒株）接種，接種后第8天與第36天對攻毒-免疫組使用北美型弱毒疫苗Ingelvac?PRRS ATP進行全組的免疫，同時對攻毒-對照組進行鹽水注射作為對照，然后選取多個時間點對豬只的血液、唾液、扁桃體與豬舍內氣溶膠中的PRRSV核酸進行了定量PCR檢測，結果表明兩組動物的病毒血癥與扁桃體帶毒的情況無明顯差異，但值得注意的是，攻毒-免疫組相較攻毒-對照組顯示出更低的氣溶膠帶毒量與唾液帶毒量。Roca等［19］將3周齡仔豬經歐洲型弱毒疫苗Amervac-PRRS?免疫六周后，使用分離自亞洲的北美型毒株HP-PRRS21株進行滴鼻接毒，發現免疫-接毒組較未免疫-接毒組豬只表現出死亡率低（0／8對2／8）、發熱程度輕、卡他性肺炎頻率低、增重高（13.4 kg對6.6 kg）與病毒血癥輕的特點，表明歐洲型弱毒疫苗能對仔豬提供部分保護效果對抗北美型高致病PRRSV。Nan等［20］發現PRRSVA2MC2株（與VR-2332株及Ingelvac PRRS MLV的堿基同源性為99.8%）接種MARC-145細胞后會造成干擾素-α2蛋白的合成，并能提升干擾素刺激基因ISG15與ISG56的轉錄水平，然后再將該毒株接種PAM細胞，發現同樣能導致上述兩個蛋白的上調，并且有少量細胞病變（cytopathic effect，CPE）出現。之后，Wang［21］等將A2MC2毒株、弱毒疫苗Ingelvac?PRRSV MLV、VR-2332株（弱毒疫苗的種毒株）及VR-2385株（中等毒力毒株）分別免疫動物進行了攻毒試驗，結果顯示A2MC2株較MLV株能更早誘導動物產生中和抗體，并產生更高的中和抗體水平與γ干擾素水平；此外，該毒株免疫動物后可以抵抗同型株或異型株的感染，同時造成與VR2385株類似的病理損傷，說明能以此毒株為基礎研發更好的疫苗。Li等［22］將15頭豬等分為3組，分別接種HP-PRRSV BB0907株、弱毒疫苗Ingelvac?PRRSV MLV與生理鹽水后放入同一豬圈飼養觀察，發現接觸感染豬在緊急免疫Ingelvac弱毒疫苗后表現出臨床發病率低、病毒血癥輕、發熱與肺部損傷輕以及γ干擾素分泌水平更高的特點，由此推測動物接觸感染HP-PRRSV時，緊急免疫弱毒疫苗可以減輕其感染。Geldhof等［23］為了探明現有商品化弱毒疫苗、滅活疫苗與自家滅活疫苗對感染PRRSV流行毒株的母豬的免疫效果，從三個PRRSV病史豬場選取母豬，采用boost免疫策略，分別免疫商品化弱毒疫苗（Porcilis PRRS?與Ingelvac?PRRSV MLV）、滅活疫苗（Progressis?）與自家滅活疫苗（使用3個豬場的流行毒株07V063株、08V194株與08V204株制備）進行促進免疫，然后從臨床癥狀、病毒血癥與抗體反應幾方面評價各自的免疫效果，結果表明商品化歐洲型弱毒疫苗Porcilis PRRS?與兩種自家滅活疫苗搭配免疫顯示出促進免疫的效果，而商品化北美型弱毒疫苗Ingelvac?PRRSV MLV與三種自家滅活疫苗都無促進免疫的效果，但是商品化歐洲型滅活疫苗與自家滅活疫苗的促進免疫效果很顯著，表明可以將自家滅活疫苗與商品化弱毒疫苗一起免疫以促進母豬的體液免疫效果。Wei等［24］為了闡明HP-PRRSV毒株HBR株在體外傳代125代致弱為F125弱毒株的機理，將HBR株的F5代、F10代與F125代毒株分別接種仔豬進行感染試驗，同時將3個毒株的基因序列進行了比對分析，結果表明F125代毒株較F5代毒株的毒力明顯致弱，F125代毒株較F5代毒株出現了45處氨基酸突變，非結構蛋白與結構蛋白中分別有33個與12個氨基酸發生了突變，且其中15個突變出現在F5傳代至F10，剩余30個突變出現在F10傳代至F125，推測F10至F125期間的30個氨基酸突變可能與毒力減弱有關，且該HBR-F125株可作為弱毒疫苗的參考株。Ni等［25］利用合成致弱病毒工程（Synthetic Attenuated Virus Engineering，SAVE）技術，使用計算機分析后將PRRSV VR2385株的GP5基因逆優化為一段保持原有功能的改造基因，然后將合成的基因片段插入感染性克隆載體中，拯救出GP5基因被逆優化的病毒SAVE5株，通過動物感染試驗證明SAVE5株較原毒株VR2385株對動物造成的病毒血癥、臨床病變與肺臟的組織病理學損傷有明顯減輕，免疫熒光試驗、TCID50試驗與實時定量PCR試驗表明SAVE5株的增殖速度要慢于原毒株VR2385株，所以該研究驗證了SAVE技術可用于病毒的快速致弱，且致弱的病毒在體內與體外都表現出了被致弱的相關特征。

嵌合病毒疫苗是弱毒活疫苗中的一種，通常采用已知特性的病毒株（受體株）作為嵌合病毒的骨架結構，然后用具有特異性免疫原性的供體株的基因替換受體株的相關基因。Ellingson等［26］將弱毒疫苗Ingelvac?PRRSV MLV與田間流行毒株MN184株基因組的不同區域進行置換，獲得了6個嵌合毒株，通過動物試驗證明了其中3株可以像傳代致弱的弱毒疫苗一樣減輕動物肺臟肉樣病變的程度，同時表明只有特定區域置換的嵌合毒株才表現出毒力減弱的特征，并且不能將毒力減弱與病毒的增殖能力減弱簡單相關聯。Ni等［27］通過DNA重組技術處理多個不同亞群毒株（FL-12株、JXA1株、NADC20株、S132株、VR2430株、VR2385株與MN184B株）的GP5基因與GP5-M基因，然后將重組的GP5基因與GP5-M基因插入感染性克隆載體獲取嵌合毒株DS722株與DS5M3株，通過動物免疫攻毒試驗發現兩株嵌合病毒都顯示出了毒力被致弱的特征，比如體內外的增殖能力減弱、病毒血癥程度減弱與接種動物病理變化減輕等，其中GP5-M基因被重組的DS5M3株可以有效對抗田間流行PRRSV感染。

3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是指使用DNA重組生物技術，把天然的或人工合成的遺傳物質定向插入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中，使之充分表達，經純化后而制得的疫苗，包括標記疫苗、載體疫苗、核酸疫苗與亞單位疫苗等。

標記（Differentiating Infected from Vaccinated Animals，DIVA）疫苗是借助基因工程技術在病毒基因組中引入分子標記，以區別于野毒株的新一代重組活疫苗，使用標記疫苗可有效區分免疫豬與野毒感染豬，對PRRSV的防控與凈化有著至關重要的作用。Lima等［28］人工缺失了PRRSV FL12株NSP2基因中的一段B細胞線性表位基因得到特定基因缺失的FLdNSP2／44株，將FL12株與FLdNSP2／44株通過一系列體內外試驗證明FLdNSP2／44株仍具有與原代類似的免疫原性、增殖特性與毒力特性，此外，免疫缺失株的仔豬血清被相應表位的ELISA檢測為陽性，表明該缺失株可用于鑒別區分免疫豬與野毒感染豬，達到了作為標記疫苗的要求。Lin等［29］在PRRSV毒株vAPRRS株的N蛋白中插入了一段標記基因獲得了標記疫苗株v7APMa株，也可穩定用以區分免疫豬與野毒感染豬。Wang等［30］將HP-PRRSV JX143株體外傳代100次得到弱毒株JXM100株，將強、弱毒株基因序列比對發現弱毒株的nsp2出現連續的88個氨基酸缺失以及全基因組中分散的75個堿基突變，體內、體外試驗發現可以利用JXM100株的88個氨基酸缺失這一特征，將其作為標記疫苗用以鑒別診斷疫苗免疫豬與野毒自然感染豬。

載體疫苗是將編碼病原體有效免疫原的基因插入載體基因組中，接種后，隨疫苗株在體內的增殖，所需的抗原得以大量表達。桿狀病毒是近年來被廣泛用于高效表達外源蛋白的載體系統，Wang等［31］、Nam等［32］和Wu等［33］都利用桿狀病毒為載體表達PRRSV的GP5與M基因，經過體內外試驗，發現新型疫苗與普通核酸疫苗相比在免疫原性上有較大的提升，刺激機體產生γ干擾素的能力與疫苗免疫劑量呈正相關。同樣，以GP5和M基因為免疫原基因，Zheng等［34］將牛痘病毒作為載體制備了具有良好體液免疫與細胞免疫反應的新型疫苗。Xu等［35］則成功構建了同時表達PRRSV-GP5蛋白與豬圓環病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）Cap蛋白的桿狀病毒。Karuppannan等［36］在普通桿狀病毒表達系統的基礎上，使用白斑綜合癥病毒迅速早期1號穿梭啟動子，構建了表達PRRSV的ORF2a、ORF3、ORF4與ORF5蛋白的桿狀病毒，其在小鼠體內試驗中顯示了良好的免疫特性。此外，以PRRSV作為載體表達其它病原基因的創意也得到了實踐，童武等［37］以弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆為平臺，成功構建了表達豬瘟病毒E2蛋白部分基因的重組毒株。

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。Zhang等［38］將來自BALB／c小鼠的分子佐劑補體蛋白C3d與PRRSV的GP5蛋白串聯后進行真核表達制備了含多重mC3d-p28基因的核酸疫苗pcDNA3.1-C3d-p28.n-GP5，與單獨表達GP5的pcDNA3.1-GP5分別接種小鼠后，發現ELISA可檢測的特異性GP5抗體、特異性GP5中和抗體、γ干擾素與白介素4在pcDNA3.1-C3dp28.n-GP5免疫小鼠體內都明顯高于pcDNA3.1-GP5免疫小鼠，表明該佐劑蛋白可以有效增強抗原的特異免疫反應，具體到本體動物豬身上的免疫效果則有待驗證。Du等［39］用VAX載體串聯了PRRSV的GP3、GP5、α干擾素和γ干擾素的基因制備核酸疫苗pVAX-α-γ-GP35，進行了短期與長期兩種免疫再攻毒的動物試驗，發現動物在免疫后第2天攻毒的情況下，該疫苗與pVAX-α-γ一樣只能提供部分保護，而當動物在免疫pVAX-α-γ-GP35后第28天經過二免，然后在第56天攻毒的情況下，該疫苗能提供完全的保護，與免疫不含α／γ干擾素的pVAX-GP35核酸疫苗的動物相比，表現為幾乎無臨床癥狀、無肺部損傷與明顯降低的病毒血癥，同時還有顯著提高的PRRSV特異性抗體反應、T細胞增殖水平、白介素4和γ干擾素的分泌水平，表明該DNA疫苗可以有效對抗HPPRRSV感染。

亞單位疫苗是指利用微生物的某種表面結構成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發機體產生抗體的疫苗。Prieto等［40］將大腸桿菌表達的GP5亞單位疫苗接種仔豬后進行攻毒試驗，發現免疫-接毒組比空白-接毒組表現出更嚴重的呼吸困難與漸進性消瘦等臨床癥狀，表明該亞單位疫苗不僅不能提供免疫保護，反而促進了PRRSV對仔豬的感染，其具體機制仍有待進一步研究。Chen等［41］將熱應激蛋白gp96的N端氨基酸位點22-370的基因（Gp96N）作為免疫佐劑與PRRSV的多個B細胞表位基因串聯之后制備亞單位疫苗，通過對小鼠與仔豬的接種試驗，發現Gp96N可有效提高小鼠／仔豬體內的淋巴細胞增殖反應、小鼠體內的γ干擾素水平、仔豬體內的α腫瘤壞死因子、γ干擾素及白介素12水平，并且白介素4水平降了一半，白介素10水平降至幾乎檢測不到，由此表明Gp96N可以有效增強多表位亞單位疫苗的先天性／適應性免疫反應。Chen等［42］又將gp96蛋白N端氨基酸22-355位點的基因與PRRSV的B細胞及T細胞表位基因串聯后制備亞單位疫苗并免疫仔豬后攻毒（JXwn06株），結果顯示該亞單位疫苗能明顯減輕仔豬的臨床癥狀。Yang等［43］將PRRSV的ORF1b、ORF7、M與GP5分別融合入以假單胞菌外毒素為基礎的載體中成功制備細胞毒性T細胞類型的亞單位疫苗，臨床試驗顯示該亞單位疫苗可有效保護仔豬與母豬對抗PRRSV感染，減輕母豬的臨床癥狀與病毒血癥。

4 結語

由于PRRSV的高頻率變異特點以及目前對其免疫保護機制的不了解，給高效可靠的疫苗研發帶來重重困難，如何克服滅活疫苗的低交叉保護力，降低甚至消除弱毒疫苗返強與重組風險，以及研發安全且具有切實免疫效果的基因工程疫苗，都是亟待解決的問題，隨著國內外學者持續升溫的研究關注，相信在不久的未來能盡早出現有效控制PRRS甚至能用以將其凈化的疫苗。

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（編輯：陳希）

Research Progress of Vaccines against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

LIU Can1，2，NING Yi-bao1?，XU Bin-rui2?
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS）is an infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus which cause serious damage to the pig industry，infected pigs specifically revealed swine reproductive disorders，respiratory system disease and weight loss.We focuses on immunogenicity and protective efficacy and safety of the vaccines against PRRS，which involved commercialization of the existing vaccine on the market reported and experimental vaccine related research achievements，so as to offer benefit to the prevention and control of PRRSV and vaccine development.

porcine reproductive and respiratory syndrome；vaccine；disease prevention and control

2014-12-24

A

1002-1280（2015）03-0058-07

S852.65

劉燦，博士，從事獸醫微生物與獸醫病理學研究工作。

寧宜寶，E-mail：ningyibao＠sina.com；徐鑌蕊，E-mail：xubr＠sina.com。