大型真菌原生質體的制備與再生研究

李晶瑩，孫婷婷，張國權，鄒莉

(東北林業大學，哈爾濱150040)

大型真菌原生質體的制備與再生研究

李晶瑩，孫婷婷，張國權，鄒莉*

(東北林業大學，哈爾濱150040)

綜述了多種大型真菌原生質體分離和再生技術，并分析了各因素對原生質體分離和再生的影響，為今后大型真菌的菌種選育和轉基因研究提供理論基礎。

大型真菌；原生質體；分離；再生

大型真菌營養豐富，藥用價值突出，自古以來深受人們喜愛，其主要包括食用菌和藥用菌兩部分。食用菌含有豐富的糖類、多種蛋白質、維生素和不飽和脂肪酸，味道鮮美，保健功能強。如木耳清爽可口，是“素中之葷”；香菇味道獨特，是“菇中之王”；金針菇口感清脆，小孩常食，能增強智力；猴頭菇不僅味道鮮美，更能養胃；雙孢蘑菇色質白嫩，肉質鮮美，營養豐富，是人們喜愛的菌類之一。藥用菌具有抗腫瘤、調節免疫力、保肝解毒、降血脂、抗血栓、抗輻射、抗菌、抗病毒、抗衰老等作用，對癌癥、腫瘤、肝臟疾病、心血管疾病等多種常見疾病均有治療保健作用，還能延緩衰老、美容養顏，提高人體免疫力[1]。如桑黃具有抗發炎、抑制腫瘤生成、抗氧化、增強免疫力，保護肝臟等作用；茯苓具有健脾和胃、寧心安神等功能，是中藥“八珍”之一，茯苓多糖對多種癌癥和腫瘤具有不同程度的抑制作用；冬蟲夏草可保肺腎、補精髓、化痰止勞咳；靈芝的提取物對高血壓、血管硬化、腦血栓、氣管炎及癌癥均有療效；樺褐孔菌精粉對糖尿病有特殊的療效；樟芝具有抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、保護肝臟等作用，可促進肝細胞再生[2-3]。除此之外，裂褶菌、灰樹花、槐耳、層臥孔菌等對多種疾病都有特殊療效[4]。

然而大型真菌的產量不高，尤其是稀有食用菌和珍貴藥用菌，其有效成分的提取量更少，為此人們愈來愈多地使用原生質體技術如原生質體融合、原生質體誘變、原生質體再生育種、原生質體轉化來獲得優良菌株，而原生質體制備和再生是原生質體技術的前提和基礎。本文通過總結了多種大型真菌原生質體分離和再生條件，并分析了各因素對原生質體分離和再生的影響，為今后大型真菌的菌種選育和轉基因研究提供科學依據。

1 原生質體制備

早期人們曾探索使用研磨等機械方法和超聲波等物理方法來制備原生質體，制備效果都不理想，目前人們主要采用酶法來制備原生質體[5]。常用的酶有溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶和崩潰酶等。

1.1 菌齡對原生質體制備的影響

菌齡不同，菌絲體的細胞壁成分和結構不同，代謝也不同。菌齡短的菌體細胞壁成分相對簡單，且較薄；隨著菌齡增大，則相反，其次生代謝物增多，酶解壁難度增加。菌齡過短，菌絲量不足，也影響原生質體得率[6]。因此，選擇在適宜的時期對菌絲進行酶解反應是十分必要的。梁清樂，郭成金等[7-8]認為菌絲對數生長期是原生質體釋放最適合的菌齡。

1.2 不同酶對原生質體制備的影響

真菌的細胞壁成分主要由幾丁質、甘露聚糖、葡聚糖等組成，其成分復雜。通常使用微生物產生的酶復合物或商品酶的混合液比單獨使用一種酶的效果好[9]。姜波[10]通過對蟲草菌原生質體的制備及誘變研究，發現溶菌酶與纖維素混合酶處理菌絲體時形成的原生質體質量最好，達到1.145×107個/mL。張卉等[11]通過對姬松茸原生質體形成和再生研究，發現溶壁酶+蝸牛酶+纖維素酶組成的酶系統效果最好。祝子坪等[12]通過對桑黃原生質體的分離與再生研究，發現溶壁酶+崩潰酶的組合酶系的酶解效果最好。

1.3 不同酶液濃度對原生質體制備的影響

制備原生質體所使用的酶液并不完全純化，其含有雜質酶，如溶壁酶(廣東微生物研究所)就含有核糖核酸酶和蛋白酶，這些酶對原生質膜有損害作用[13]。一定范圍內，酶濃度越高，原生質體的產量也越大，當酶的濃度超過一定值后，原生質體的質量開始下降，甚至急劇下降，這就是雜酶所造成的。并且，酶濃度過大，原生質體脫壁太徹底，再生也會受到嚴重影響[5]。呂龍等[14]通過正交設計法探討茯苓原生質體的最佳制備條件發現，酶解1 h茯苓原生質體的產量最高；2 h茯苓原生質體的數量迅速下降；之后茯苓原生質體的數量又逐漸增多，他分析可能是所用酶液濃度較高，菌絲體的菌齡較小，所以酶濃度和菌絲體的菌齡對原生質體制備具有嚴重影響。此外，有研究表明高濃度的酶對原生質體有一定的損傷[15-16]。

不同菌絲的細胞壁組成差異顯著，酶解所需的酶液濃度也隨之變化。王淑珍等[17]發現用2.5%溶壁酶+0.5%崩潰酶酶解松茸菌絲體得到原生質體的效果較好；曹文芩等[18]等發現使用3%的溶壁酶和蝸牛酶的混合液酶解靈芝菌絲獲得原生質體的效果最好；張麗霞等[19]發現使用2%溶壁酶酶解豬苓菌絲得到原生質體的效果較好。

1.4 不同滲透壓穩定劑對原生質體制備的影響

常用的滲透壓穩定劑主要是無機鹽、糖類或醇類，如氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，硫酸鎂，蔗糖，葡萄糖，甘露醇等。滲透壓穩定劑常用濃度為0.5～0.6mol/L[17]。滲透壓穩定劑能夠維持原生質體內外滲透壓平衡，對原生質體形態和活性有著重要作用，然而不同原生質體最適的滲透壓穩定劑也不同。郭成金等[8]通過利用正交試驗對冬蟲夏草原生質體的制備與再生的研究，發現糖醇類物質黏度過高，大大降低或抑制了酶的反應活性，而以0.6mol/L的KCl作滲穩劑，則有助于酶與底物的結合，對酶解反應起促進作用。李剛等[20]發現硫酸鎂很易和瓊脂反應產生大量沉淀，從而難以凝固或凝固后仍有較高的流動性，妨礙再生實驗的進行。

1.5 不同酶解溫度對原生質體制備的影響

酶促反應深受溫度的控制，在不同溫度下，酶活性不同，酶解效果也不同。低溫會降低酶促反應速率，而高溫可能會降低酶活性和損傷已游離的原生質體[19]。溶壁酶的最適酶解溫度為25～35℃，而每克菌絲細胞經30～40mg蝸牛酶在37℃下保溫1h即可溶解細胞壁，破壁率達90%以上。不同菌類、不同的酶，其最適酶解溫度不同[6]。鄒莉等[21]發現在32℃條件下用溶壁酶酶解，亞側耳原生質體的產量最高。勾麗莉等[22]發現在34℃條件下，用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶酶解，血紅鉚釘菇原生質體的產量最高。王謙等[23]發現在25℃，1%蝸牛酶+1%纖維素酶條件下酶解，玉蕈原生質體產量最高，高于或低于25℃，原生質體產量都會降低。另外，原生質體活力最高時的溫度并非產量最高時的溫度[24]。

1.6 不同酶解時間對原生質體制備的影響

一般地，隨著時間的延長，有越來越多的菌絲被酶解，釋放出球狀的原生質體，但當達到一定時間后，抗逆能力差的原生質體長時間暴露在酶液中，一些雜酶不斷破壞原生質體膜，使得原生質體破碎，原生質體數量下降，活性也受到影響[25]。因此，確定好酶解時間是至關重要的。不同菌絲的細胞壁構成和厚薄不同，使用的酶不同，所需要的酶解時間也不同。王昱等[26]發現酶解2.5h時靈芝原生質體的數量最多。許謙[27]發現酶解3h時桑黃原生質體的數量最多。

1.7 不同pH對原生質體制備的影響

pH是影響酶活的重要因素，在不同的pH下，酶的活性大大不同。陳敏等[28]發現用溶壁酶酶解杏鮑菇菌絲，在酶液的pH 為4.5～5時效果最好。張李陽[29]發現溶壁酶酶液的pH為5.5時，靈芝原生質體的產量最高，但在pH 5.0～6.5范圍內，再生率的變化不甚明顯，建議采用緩沖液配制酶液。

1.8 不同預處理方式對原生質體制備的影響

有研究表明酶解前對菌絲進行適當的預處理，原生質體的產量明顯不同。沙濤等利用2-硫基蘇糖醇(DDT)、硫代乙醇酸鈉和B-巰基乙醇等3種預處理液對松茸菌絲進行預處理，發現經2-硫基蘇糖醇(DDT)處理過的菌絲的原生質體制備率明顯高于其它兩種預處理液處理過的菌絲以及未處理的菌絲[25]。

2 原生質體再生

2.1 不同培養方式對原生質體再生的影響

培養方式不同，原生質體再生率不同。周禮紅等[30]通過對蛹蟲草原生質體的制備與再生的研究，發現用雙層平板法培養的原生質體再生率高。李剛等[20]通過對靈芝原生質體分離和再生的研究發現在雙層平板法中，上層瓊脂濃度越低，原生質體再生率越高；當上層瓊脂濃度為0.2%，原生質體的再生效果最好(當上層瓊脂濃度低于0.2%時，上層平板難以凝固，影響了再生菌落的計數)。

2.2 不同再生培養基對原生質體再生的影響

不同的菌種需要的養分不同，而不同的培養基所含有的養分也不同，所以選好再生培養基至關重要。周禮紅等[30]用含有0.6mol/L蔗糖的PDA、沙氏、Vogel’s培養基作再生培養基培養蛹蟲草原生質體，發現含有0.6mol/L蔗糖的PDA培養基的效果最好。祝子坪等[12]用含有0.6mol/L滲透壓穩定劑的PDA再生培養基、PDA+桑枝再生培養基、麥芽糖酵母粉再生培養基、纖維二糖再生培養基培養桑黃原生質體，發現含有0.6mol/L滲透壓穩定劑的PDA+桑枝再生培養基的效果最好。

2.3 不同滲透壓穩定劑對原生質體再生的影響

原生質體分離和再生是兩個完全不同的過程，分離原生質體是細胞壁的分解，而原生質體再生是破碎的細胞壁的重新生成，細胞結構和功能恢復，細胞正常分裂和生長的過程，而糖類和醇類作為再生培養基的滲透壓穩定劑，既可以維持原生質體的形態，又可以作為營養因子，提供其再生物質的保證[8]。祝子坪，曹文芩等[12,18]發現甘露醇作為再生培養基的滲透壓穩定劑再生率高；王昱, 周禮紅等[26,30]發現蔗糖作為再生培養基的滲透壓穩定劑時再生率高。祝子坪等[12]在試驗中發現以氯化鈣和硫酸鎂為滲透壓穩定劑時，培養基很難凝固，即使凝固后仍有較高的流動性，妨礙再生試驗的進行。

3 結語與展望

食用菌產業是一項集經濟效益、生態效益和社會效益于一體的短平快農村經濟發展項目，食用菌又是一類有機、營養、保健的綠色食品。發展食用菌產業符合人們消費增長和農業可持續發展的需要，是農民快速致富的有效途徑。如何獲得生長周期短、營養豐富、口感良好、抗病能力強的食用菌菌種是科研工作者一直努力的方向。

近年來，大型真菌藥劑的研制一直是新藥開發的重要領域。自1985年實施《藥品管理法》以來，經部、省批準的大型真菌單方或復方制劑有100多個品種，充分顯示出大型真菌制劑在醫藥方面的光明前景[31]。

原生質體技術為上述問題的解決提供了研究思路。原生質體的制備和再生是原生質體技術的基礎和前提。在原生質體制備和再生過程中可以引起菌種各種各樣的變化，如菌落形態、菌絲生長速度、營養缺陷型或抗藥性的回復突變、質粒的消失以及產量、質量等方面的變化。因此，原生質體形成和再生技術也可以作為菌種改良的一種手段[32]。原生質體融合和外緣DNA導入原生質體技術能夠有效克服遠緣雜交的障礙，大大加快了育種進程。逐步實現稀有大型真菌原生質體的制備與再生，能夠更有效地保護、改良和利用野生種質資源。

原生質體制備和再生受多種條件影響，且不同菌種的制備和再生條件差異大，在原生質體的制備和再生中應綜合考慮各種因素，尋求最佳條件。

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Research on Formation and Regeneration of Protoplast of Macrofungi

Li Jingying , Sun Tingting, Zhang Guoquan, Zou Li*

(Northeast Forestry University, Harbin 150040)

This paper summarized protoplast preparation and regeneration technology of various macrofungi and analysed factors influencing protoplast preparation and regeneration of macrofungi, which provides theory basis for the research on breeding and transgene of macrofungi in the future.

Macrofungi; Protoplast; Formation; Regeneration

2015-04-08

Q813.2

A

*通訊作者：鄒莉(1966-)，女，教授，主要從事食藥用菌的教學與研究，E-mail：13903650896@163.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.038