桿狀病毒囊膜蛋白介導病毒侵染宿主細胞中的作用

宋振輝，封海波，張鸚俊

（1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460；2.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；3.西南大學榮昌校區圖書館，重慶 榮昌 402460）

桿狀病毒（Baculovirus）是一類在自然界中專一性感染節肢動物的DNA病毒，在分類學上屬于桿狀病毒科（Baculoviridae），其宿主主要包括鱗翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和雙翅目（Diptera）昆蟲。基于桿狀病毒全基因組序列構建的系統進化樹，將桿狀病毒科劃分為4 個屬：Alpha 桿狀病毒屬（以鱗翅目昆蟲為特異宿主的NPV），Beta桿狀病毒屬（以鱗翅目昆蟲為特異宿主的GV），Gamma桿狀病毒屬（以膜翅目為特異宿主的NPV）以及Delta桿狀病毒屬（以雙翅目為特異宿主的NPV）[1-2]。目前，廣泛用于攜帶外源基因表達的桿狀病毒僅限于核型多角體病毒（NPV）。該病毒在它的生活史上會形成兩種形式：包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）和出芽病毒粒子（budded virus，BV）。病毒感染宿主細胞早期，主要產生病毒粒子BV，到了感染晚期，則BV減少，逐漸過渡到只產生ODV。因為這兩種病毒粒子具有相同的核衣殼，不同的囊膜組成分，致使它們侵入宿主細胞的方式有所差異[3]，在自然界中，ODV介導口服感染，BV介導系統感染，BV可以轉導哺乳動物細胞，但不能繁殖。近年來，許多研究人員致力于桿狀病毒侵入宿主細胞的研究，對介導ODV口服感染的囊膜蛋白有了新的發現，對BV進入細胞的機制，特別是可轉導哺乳動物細胞的種類進行了積極探索，本文就桿狀病毒ODV和BV囊膜蛋白介導病毒侵染宿主細胞中的作用最新進展作一簡要論述，希望為研究桿狀病毒侵入細胞機理及其作為哺乳動物細胞基因傳遞載體提供參考。

1 桿狀病毒ODV膜蛋白在侵染宿主細胞中的作用

ODV病毒粒子包括10 余種囊膜蛋白，其中6 種囊膜蛋白被鑒定為病毒口服感染昆蟲幼蟲的必需蛋白，分別為P74（PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4）和PIF5，在ODV感染過程中，除了PIF5 蛋白不作為PIF復合體的組份，其余囊膜蛋白之間通過非共價健相互作用以PIF 復合體的形式發揮功能[4]，3 種蛋白PIF1、PIF2 和P74 被證明在病毒粘附宿主細胞過程中具有重要作用，缺失3 種蛋白的任何一個將喪失病毒口服感染的能力。研究表明，PIF1、PIF2和PIF3形成穩定的復合體存在于AcMNPVODV病毒粒子的表面，此復合體能夠抵抗2%SDS和5%β巰基乙醇在50 ℃條件下作用5 min，免疫共沉淀分析表明，PIF復合體具有一個穩定的結構，當PIF4 基因缺失時，PIF1、PIF2 和PIF3 始終能夠形成穩定的復合體。但是，缺失PIF1、PIF2 或PIF3 將導致復合體的破裂，因此，穩定的PIF 復合體能夠進一步的分成兩種組成單位，即PIF1、PIF2 和PIF3 形成的穩定核心，然后PIF4 緊密地與這個穩定的核心結構結合。研究表明，由PIF1、PIF2、PIF3、PIF4 形成的復合體在桿狀病毒口服感染的起始階段具有重要作用[5]。P95 和P74（PIF0）也與PIF1-4 復合體松弛地結合，P95 被核心基因編碼，除了在自身啟動子和宿主肌動蛋白基因的驅動下能夠表達外源基因，P95 還具有殼多糖結合能力[6]，可能調節ODV與圍食膜或中腸上皮細胞的相互作用。P95可能是病毒體外感染的必需基因，因為缺失P95 的桿狀病毒DNA不能產生感染性病毒粒子[7]，在多個包埋型核多角體病毒（MNPV）中，P95 被發現是BV和ODV的一種成分，但最近通過蛋白質組學分析在苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Ac-MNPV）BV結構蛋白中沒有P95 的存在。在ODV感染過程中，Ac5、Ac68 和Ac108 被鑒定為病毒粒子口服感染的必需膜蛋白，通過基因插入缺失和變異的方法，證明此3 種膜蛋白可參與PIF 復合體的組成，但卻為病毒復制的非必需蛋白[8-9]，關于Ac5、Ac68和Ac108 與PIF 復合體的相互作用方式及其在病毒感染過程的具體作用有待進一步闡明。

2 桿狀病毒BV膜蛋白在侵染宿主細胞中的作用

桿狀病毒BV是通過膜蛋白gp64 或F 蛋白與宿主細胞的未知受體相互作用，以內吞體的形式進入宿主細胞。在內吞體（endosome）低pH 值誘導下（pH＜5.5），使細胞膜構象發生改變引發BV包膜與內吞體膜的融合，從而釋放核衣殼進入細胞質。研究表明，gp64 的糖基化修飾和三聚體蛋白的形成對于病毒的吸附和膜融合至關重要[10]。缺失糖基化位點的桿狀病毒對昆蟲細胞的吸附能力顯著降低，破壞gp64 三聚體蛋白亞基間的二硫鍵也將抑制gp64 的融合活性。分子進化分析表明，核多角體病毒Ⅰ型如AcMNPV和OPMNPV膜融合蛋白為gp64，核多角體病毒Ⅱ型缺乏gp64的同源基因，具有膜融合F 蛋白，F 與gp64 蛋白在氨基酸序列上沒有同源性，但與gp64 功能相似，也具有低pH 值誘導的膜融合活性。桿狀病毒通過識別宿主細胞受體，以內吞作用進入胞內，這種方式不只限于昆蟲細胞，AcMNPV同樣能通過相同方式進入哺乳動物細胞。

桿狀病毒BV進入哺乳動物細胞，可在合適的哺乳動物細胞啟動子控制下表達外源基因。近年來，利用桿狀病毒將抗原遞呈給哺乳動物細胞已受到廣泛關注和應用。不同動物來源的細胞，重組桿狀病毒的侵染效率存在差異，已知桿狀病毒可進入的宿主細胞系包括人源Huh7、HepG2 細胞、豬源腎細胞系CPK、FS-L3 細胞、鼠源原代腎細胞、CHO、BHK細胞、牛源MDB、BT 細胞及不同哺乳動物骨髓來源間充質干細胞（BMSC）等[11-12]。目前關于桿狀病毒BV進入哺乳動物細胞的詳細機理尚不清楚，現在普遍認為桿狀病毒可能通過某種受體介導的內吞作用進入細胞，內吞泡中的低pH 值條件可誘導病毒包膜蛋白gp64 的構象發生變化，使膜融合區域暴露并與內吞泡膜融合釋放出病毒核衣殼。

Duisit 等認為病毒與細胞之間的靜電相互作用及細胞表面的硫酸乙酰肝素可能在此過程中起重要作用[13]。也有報道細胞表面的磷脂可能是桿狀病毒囊膜蛋白gp64 的重要識別、結合位點，他們認為桿狀病毒的gp64 蛋白可能識別哺乳動物細胞表面的某種特殊受體從而介導病毒進入細胞內[14]。實驗表明，桿狀病毒囊膜蛋白gp64 在吸附哺乳動物細胞和內體逃逸的過程中發揮著重要作用[15]。缺失gp64 基因的桿狀病毒無法進入哺乳動物細胞，而高效表達gp64 蛋白的桿狀病毒可顯著提高報告基因在哺乳動物細胞中的表達效率，已知哺乳動物細胞表面的磷脂充當了gp64的“碼頭”，有利于病毒接觸細胞，除此之外，宿主細胞中是否有與gp64 特異性結合的蛋白參與病毒進入細胞的過程還不明確。

目前，利用桿狀病毒作為外源基因表達載體的研究報道日益增多，如在研究口服免疫疫苗方面，基于桿狀病毒作為載體表達病毒樣顆粒（VLPs），進而評價其免疫效果，不妨是一種良好的研究思路。本課題組利用桿狀病毒為表達載體，在昆蟲細胞內成功表達了豬傳染性胃腸炎病毒樣顆粒[16]，目前正在評價病毒樣顆粒誘導機體黏膜免疫效果。總結國內外與我們應用桿狀病毒構建病毒樣顆粒的研究，都客觀存在一定的不足，如VLPs 的表達量低、VLPs 的純化困難，易于被胃腸道降解等。桿狀病毒BV可以轉到哺乳動物細胞，利用這一特性，實現桿狀病毒經黏膜途徑免疫機體，在宿主細胞內表達外源蛋白，進而激發機體黏膜免疫應答，將會避免以上的不足，值得進一步探討。

3 研究展望

在桿狀病毒ODV口服感染過程中PIF 復合體蛋白質之間的相互作用是必需的，以前的研究證明，PIF 復合體包括PIF1、PIF2、PIF3、和P74，最新研究揭示更多的PIF 組成成分，至于新發現膜蛋白與PIF 之間的相關作用關系及其在病毒感染意義，PIF 復合體的宿主受體，及其ODV進入宿主細胞過程中復合體的構象變化等還需進一步深入研究。利用桿狀病毒BV可轉導哺乳動物細胞這一特性，已有越來越多關于桿狀病毒作為基因轉移載體的應用報道，如在動物基因工程疫苗、基因治療、病毒樣顆粒的組裝等領域中應用桿狀病毒的研究日益增多，但目前還有亟待解決的問題，如桿狀病毒敏感的哺乳動物細胞還有那些，以及桿狀病毒進入哺乳動物細胞的機制等，相信這些問題的闡明，將為揭示桿狀病毒侵入宿主細胞機理及其作為表達載體系統提供重要的理論依據。

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