反向遺傳技術及其在豬病防控研究中的應用

祖立闖，李 嬌，張 倩，莊金秋，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

反向遺傳技術及其在豬病防控研究中的應用

祖立闖1，李 嬌1，張 倩2，莊金秋3，李 峰3，沈志強1，3

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

反向遺傳技術與經(jīng)典的從表型改變到進行基因特征研究的思路相反，是指通過在體外構建病毒的感染性cDNA克隆，通過病毒拯救獲得低毒力的弱毒株，并且新毒株的免疫原性保留，可以作為弱毒疫苗而廣泛應用到豬病防控中，將是未來新型豬病疫苗研究的發(fā)展方向。文章針對反向遺傳技術在豬病防控中的研究概況作一簡要綜述，以期為加強我國新型疫苗研究開發(fā)和提高我國豬病防控能力提供參考。

反向遺傳技術；豬病防控；應用

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的現(xiàn)代化、規(guī)模化快速發(fā)展，以疫苗免疫接種為主的動物疫病防控體系亦得到不斷完善，但在臨床中日益表現(xiàn)出溫和型和非典型病變，給豬病的綜合防控提出了新的挑戰(zhàn)。故加強新型疫苗尤其是基因標記疫苗的研究日益得到重視，反向遺傳操作技術能夠利用生物信息學技術對微生物基因組序列進行分析，在對靶基因進行必要的定點突變和基因置換等加工和修飾后，再按組成順序構建和裝配出具有生命活性的個體。與傳統(tǒng)疫苗相比，反向遺傳技術構建的新型疫苗株具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復率低的優(yōu)勢，并且能夠通過標記基因?qū)崿F(xiàn)與野毒株的鑒別診斷。隨著基因組學、生物信息學和分子生物學技術的快速發(fā)展與應用，近幾年反向遺傳技術在豬病方面的研究亦得到不斷發(fā)展和深入，本文針對反向遺傳技術在豬病防控中的研究概況作一簡要綜述，以期為加強我國新型疫苗研究開發(fā)和提高我國豬病防控能力提供參考。

1　動物病毒的反向遺傳系統(tǒng)

動物病毒的反向遺傳操作通過感染性克隆的構建，可以進一步了解病毒的基因和功能，闡明病毒的起源和致病機制，開發(fā)新型疫苗及病毒載體疫苗。突破了對單一基因研究的局限，從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置換或構建嵌合病毒等方法對病毒基因功能進行研究。目前動物病毒的反向遺傳操作研究的手段主要包括以T7 RNA聚合酶為基礎的病毒拯救系統(tǒng)、真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系統(tǒng)、真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系統(tǒng)、polⅠ-polⅡ雙啟動子拯救系統(tǒng)。

2　幾種主要豬病的反向遺傳操作系統(tǒng)

2.1豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)方面的研究比較多，國內(nèi)孟沙沙等［1］分別構建了H1N1亞型豬流感病毒JS40株8個基因節(jié)段的重組質(zhì)粒，經(jīng)轉染293T和MDCK混合細胞，拯救出病毒R-JS40株，序列測定結果表明，救獲病毒與親本病毒的核苷酸序列一致，無氨基酸變異，可以穩(wěn)定傳代，抗原性未發(fā)生變化，對小鼠的致病性結果顯示R-JS40與JS40對小鼠的組織嗜性以及在肺臟中復制的病毒滴度基本一致，表明R-JS40保持了親本病毒JS40的生物學特性，該病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立，為進一步開展關于病毒的致病分子基礎以及新型疫苗的研制提供有效的技術平臺。黃夢等［2］利用RT-PCR技術擴增豬流感病毒A/swine/ Shanghai/1/07株H1N2的8個基因片段，分別克隆至雙向轉錄表達載體PBD上，構建出8個能在哺乳細胞中復制和表達的質(zhì)粒。將8個質(zhì)粒共轉染293T細胞，收取轉染48 h時的細胞上清液并接種9～11日齡SPF雞胚，成功拯救出有血凝活性的病毒。經(jīng)序列測定，確定拯救病毒的8個基因片段均來自豬流感病毒A/swine/Shanghai/1/07株H1N2基因。H1N2亞型豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為豬流感病毒致病機理、傳播機制及病毒基因功能的研究奠定了基礎。同時，為H1N2亞型豬流感新型疫苗的研制開辟了新的途徑。譚力凱等［3］通過試驗構建了包含有GDK6毒株基因的8個重組質(zhì)粒，轉染293T細胞后成功拯救出病毒rGDK6。救獲病毒與親本病毒擁有相同基因序列，其抗原性、經(jīng)HI試驗、TCID50試驗和小鼠攻毒試驗表明，救獲病毒的生物學特性與對小鼠的致病性與親本病毒一致。禽源豬流感H6N6病毒的反向遺傳系統(tǒng)的成功建立，為進一步研究H6亞型流感病毒的分子致病機理與病毒基因功能及新型疫苗創(chuàng)制提供了技術平臺。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

徐彥召等［4］采用分子生物學方法改造pBluescriptIIsk（+）載體的多克隆位點并使其獲得CMV啟動子序列，在獲得該病毒的全長cDNA克隆的基礎上，采用酶切、連接、轉化等方法將該病毒的全長cDNA置于CMV真核啟動子序列的下游，獲得含有CMV啟動子和PRRSV XX-2012株全長cDNA克隆的重組質(zhì)粒pSK-CMV-XX-2012。最后，將重組質(zhì)粒直接轉染Marc-145宿主細胞后，拯救出PRRSV XX-2012株。病毒生長特性試驗結果顯示，拯救病毒與親本病毒在Marc-145細胞上具有相似的增殖特性，且拯救病毒序列含有不同于親本病毒的分子標記（突變產(chǎn)生的MluI酶切位點），該研究建立了一種研究PRRSV反向遺傳操作系統(tǒng)的簡單、快速、節(jié)約時間和成本的方法。李燕華［5］等在已構建完成的高致病性PRRSV細胞傳代毒株反向遺傳系統(tǒng)（pAJXM）的基礎上，將T 7啟動子換成hCMV啟動子，從而全長cDNA克隆不需經(jīng)過體外轉錄成mRNA的過程，直接通過DNA轉染Marc-145細胞拯救病毒，研究發(fā)現(xiàn)基于NDA轉染的反向操作系統(tǒng)是可行的，并且hCMV啟動子的TATA框與病毒基因組5′末端之間的堿基數(shù)目設置為25和在病毒基因組3′末端添加HDVr序列后，能夠有效地提高全長感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和穩(wěn)定性。

2.3口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

口蹄疫病毒是一種高度接觸性的烈性傳染病，它有7種血清型，病毒基因組很容易發(fā)生變異，病毒的結構和功能尚未完全闡明，通過反向遺傳技術可以研究病毒的結構和功能，通過體外構建病毒感染性分子克隆，研究病毒的復制與表達調(diào)控機理，研究病毒與宿主的相互關系［6］。Li S等［7］構建了亞洲1型口蹄疫病毒的感染性分子克隆，動物實驗證明該克隆病毒的毒力與復制動力學與親本病毒相似，該克隆病毒可以在BHK-21細胞中復制。克隆病毒缺少3A結構中91～104氨基酸，構建的缺少免疫表位的FMDV突變毒株可作為滅活疫苗候選毒株，為新型弱毒疫苗研究奠定基礎。

2.4豬圓環(huán)病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

王偉丞［8］等參考GenBank中已發(fā)表的I型豬圓環(huán)病毒序列，設計1對特異性引物，通過PCR擴增PCV-1全長基因組序列，將其定向克隆至pcDNA3.1（+）真核表達載體中，對其進行PCR、雙酶切鑒定及DNA序列測定，將構建好的重組質(zhì)粒轉染到PK-15細胞中，經(jīng)3次連續(xù)傳代，用PCR方法檢測轉染后盲傳細胞中PCV-1核酸，經(jīng)序列鑒定所拯救出的病毒與親本病毒核苷酸同源性100%。結果表明所構建的PCV-1感染性克隆具有感染性。PCV-1反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為進一步研究PCV基因組的功能及新型疫苗的研發(fā)奠定基礎。

3　反向遺傳操作技術在動物新型疫苗研究中的應用前景

通過反向遺傳操作技術在新型動物疫苗研究中的不斷應用，可以尋找出與毒力相關位點，通過對毒力決定性基因的缺失或修飾得到一種無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗。如缺失口蹄疫病毒細胞吸附位點的編碼序列或前導蛋白酶的編碼序列可得到口蹄疫病毒的減毒毒株，將其作成減毒活疫苗免疫動物可獲得較好的免疫效果。另外還可以研制嵌合疫苗，開發(fā)多價疫苗。利用感染性克隆作為現(xiàn)有減毒活疫苗的種子批，可以減少生產(chǎn)批次間的差異，保持疫苗的穩(wěn)定性和安全性。總之，反向遺傳操作技術作為動物病毒病研究的一種新型方法，已經(jīng)廣泛應用到各種新型動物疫苗研究中。當前，國內(nèi)外學者正在不斷致力于各種新型高效疫苗的研發(fā)，反向遺傳學的興起，極大的推動了動物病毒疫苗研究的發(fā)展方向，為動物疾病的防控起到至關重要的作用。

［1］ 孟沙沙， 喬傳玲， 陳艷， 等. 一株類禽型H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立［J］.中國預防獸醫(yī)學報， 2013，35（2）： 91-94.

［2］ 黃夢， 于海， 周艷君， 等. H1N2 亞型豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立［J］.中國動物傳染病學報， 2011， 19（3）： 19-22.

［3］ 譚力凱， 張民澤， 邵振文， 等. 1 株禽源豬流感 H6N6 病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立［J］.中國獸醫(yī)雜志， 2014， 50（10）：6-8.

［4］ 徐彥召，王青，張慧輝，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構建［J］. 中國獸醫(yī)科學，2015，45（8）：794-801.

［5］ 李燕華，韋祖樟，譚菲菲，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞傳代毒株反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化［J］.中國動物傳染病學報，2010，18（3）： 13-20.

［6］ 任方，易忠，郭會玲，等. 口蹄疫病毒反向遺傳技術研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35 （11）：84-87.

［7］ Li S， Gao M， Zhang R， et al. A mutant of Asial serotype of Foot-and-mouth disease virus with the deletion of an important antigenic epitope in the 3A protein［J］. Can J Microbiol， 2011， 57（3）：169-176.

［8］ 王偉丞，曾智勇，湯德元，等. 豬圓環(huán)病毒1型反向遺傳操作系統(tǒng)的初步構建［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（9）：124-126.

2015-10-23）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

祖立闖（1981年5月-），男，漢族，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究工作。 E-mail：zulichuang2008@126.com