輔助免疫治療對侵襲性真菌感染的作用

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輔助免疫治療對侵襲性真菌感染的作用

王姣焦孫航

(重慶醫科大學附屬第二醫院病毒性肝炎研究所，重慶400010)

關鍵詞〔〕侵襲性真菌感染；疫苗；集落刺激因子；炎性細胞因子；過繼免疫治療

第一作者：王姣焦(1988-)，女，在讀碩士，主要從事深部真菌感染的致病機制的研究。

侵襲性真菌感染又叫侵襲性真菌病(IFD)。主要病原菌為念珠菌、曲霉菌和隱球菌，其中最常見的致病真菌為假絲酵母菌，主要包括白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌。雖然，白假絲酵母菌占首位，但所占比例逐年下降，而其他假絲酵母菌引起的深部真菌感染正逐年上升〔1〕。正常情況下，寄生于人體內的真菌不會危害機體，但當機體的免疫狀態低下時就容易致病。在美國一個全國性的監測研究表明，在重癥監護病房的侵襲性真菌感染患者的死亡率為47%，而在普通病房的死亡率為29%，居院內血液感染病原體第3位〔2〕。由于侵襲性真菌感染無特殊的臨床癥狀和體征，且往往被原發病或合并其他感染所掩蓋，目前尚無快速、可靠、有效的診斷方法；盡管已經開發了許多有效的抗真菌藥物，但由于嚴重的毒副作用及耐藥菌株的出現，使侵襲性真菌感染的防治已成為臨床的棘手問題。進一步了解深部真菌感染的發病機制和機體的免疫應答，有助于新的抗真菌藥的開發或提供新的治療方法。

1侵襲性真菌感染時機體的免疫反應

侵襲性真菌感染時，機體的免疫反應對真菌病原體的清除起著非常重要的作用。機體的皮膚屏障、呼吸道、消化道及泌尿生殖道的黏膜上皮，微生物的拮抗及防御素等構成了機體抗真菌感染的第一道防線；同時，吞噬細胞具有殺滅真菌及抑制真菌的生長和感染的作用；且樹突細胞(DC)表面的模式識別受體(PRRs)能識別真菌細胞壁上的病原體相關分子模式(PAMPs)，從而激發機體固有免疫反應，誘導適應性免疫并呈遞抗原肽給T 細胞〔3,4〕。

在適應性免疫中，DC首先識別、呈遞抗原，然后通過不同的細胞信號因子通路誘導輔助性T細胞(Th)分化成Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞或CD24+CD25+調節性T細胞(Tregs)，引起一系列炎性細胞因子釋放。Th1細胞誘導促炎細胞因子的產生，如白細胞介素(IL)-6、IL-12、IL-18、干擾素(IFN)-γ；而Th2細胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10、IL-13具有抑制效應細胞的抗真菌作用〔3～5〕。近來，Th17在侵襲性真菌感染方面的作用也進行了研究，但它在這方面的具體作用仍不是很清楚。Huang等〔6〕發現，缺乏IL-17AR基因的小鼠患侵襲性真菌感染后死亡率增加并且增快；然而，也有報道說Th17細胞在某些真菌感染的小鼠動物模型中具有損傷作用〔7〕。而Treg細胞則通過抑制Th17細胞亞群的擴大和減少機體損傷來調節Th1/Th17的平衡〔8〕；同時，Treg細胞也能增加Th17細胞的反應和促進真菌的清除〔9〕。

2抗真菌免疫治療

近來，雖然已經開發了許多有效的抗真菌藥物，但由于耐藥菌株的出現及其嚴重的毒副作用，使侵襲性真菌感染的防治成為臨床的棘手問題。1997年時就有學者提出，通過輔助免疫治療可減少傳統的抗真菌藥的劑量，縮短使用時間，增加抗真菌藥的效果，并減少其毒副作用。

2.1疫苗自從天花疫苗出現后，威脅人類幾百年的天花病毒便被徹底消滅了。隨后，也出現了一些嚴重的致命的細菌和病毒的疫苗，但一直沒有抗真菌疫苗出現過。隨著侵襲性真菌感染的發病率和死亡率持續上升，對真菌疫苗的研究也越來越受到相關人士的關注，目前也取得了一定程度的進展。現在，大多學者主要認為單克隆抗體(mAbs)有助于增強機體對真菌的先天免疫反應和Th1細胞介導的適應性免疫反應。在1988年曾有文獻報道用抗新生隱球菌莢膜多糖的單克隆抗體治療感染的小鼠后，發現組織的隱球菌菌量減少，且小鼠的生存期延長；更早期也報道了3例用兩性霉素B聯合抗新生隱球菌兔抗體治療急性隱球菌性腦膜炎的病人，他們發現有2名患者血清中隱球菌抗原滴度轉化為陰性。現在已有2個抗真菌的單克隆抗體進行臨床試驗評價。mAb 18B7是一種抗新生隱球菌莢膜多糖的單克隆抗體，在臨床Ⅰ期劑量遞增研究中，發現mAb 18B7對新型隱球菌患者的治療是有效的。受試對象分為6個劑量組，在0.01、0.05、0.2、0.5 mg/kg mAb 18B7組的患者無明顯的副作用；1 mg/kg組的患者有輕微的副作用，如短暫的惡心、嘔吐、疼痛和蕁麻疹；而在2 mg/kg組的患者則會發生輕至中度的惡心、嘔吐、寒戰、肌痛等。以上這些數據表明，mAb 18B7最大單劑量為1 mg/kg〔10〕。另一個抗體是Mycograb，它是一種抗真菌熱休克蛋白90的單克隆抗體。Hodgetts等〔11〕在一個臨床前研究中發現，Mycograb對廣泛的白色念珠菌屬有活性，且能夠增加兩性霉素B和卡泊芬凈的抗真菌作用。除了以上兩個抗體，目前還有一些其他抗體也在研究當中，如煙曲霉細胞壁糖蛋白mAb A9、反β-1,3-葡聚糖mAb 2G8、抗甘露糖蛋白mAb C7、抗甘露聚糖mAb、抗糖mAb等。

Neely 等〔12〕用兩性霉素B結合人免疫球蛋白靜脈注射深部真菌感染的小鼠后，發現機體的抗真菌反應能力增強，小鼠的生存期延長。然而，免疫球蛋白對患者的作用仍具有爭議性。有學者對肝移植的患者給予免疫球蛋白和阿昔洛韋預防治療，結果和安慰劑組相比，真菌感染的發生率顯著減少。而另一學者在一項隨機研究中發現，和安慰劑組相比，接受免疫球蛋白的骨髓移植患者并沒有阻止嚴重的真菌感染的發生。

另一種真菌疫苗是細胞表面疫苗，凝集樣序列1(ALS1)基因的蛋白產物是一種黏附素，能調節白念珠菌與人體細胞的結合力。Ibrahim等〔13〕對接種致死劑量白色念珠菌的小鼠給予真菌疫苗(Als 1p)治療后發現，疫苗通過增加機體Th1免疫反應提高小鼠的生存率。且對T細胞缺陷的小鼠無保護作用，但對B細胞缺陷的小鼠有保護作用，這表明Als 1p疫苗的作用機制是刺激細胞免疫，而不是體液免疫。另一個真菌疫苗是一個菌絲共表達基因(HYR 1)產物，它是一個真菌毒力因子，能夠抵抗吞噬細胞的殺傷作用。重組疫苗(HYR 1p)能夠改善小鼠播散性念珠菌病的嚴重程度〔14〕。

2.2集落刺激因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種調節造血細胞增殖和分化，分子量為22 kD的糖蛋白的細胞因子。 van Eijk等〔15〕發現GM-CSF可誘導巨噬細胞的殼三糖甘酶的表達，而這種酶可破壞真菌細胞壁的幾丁質物質，從而起到殺真菌的作用。Vazquez等〔16〕對合并氟康唑難治性黏膜念珠菌病的艾滋病患者給予GM-CSF作為免疫輔助治療，結果發現患者臨床癥狀和體征改善，且沒有副作用。雖然，目前一些研究證明，GM-CSF對侵襲性真菌感染的治療是有益的，但目前的實驗是有限的，尚缺乏對照實驗。同時，GM-CSF治療的時間不能太長，否則容易引起嚴重的毛細血管滲漏綜合征。

粒細胞集落刺激因子(G-CSF)可促進中性粒細胞的增殖與分化，并增加中性粒細胞的抗真菌活性。Kullberg等〔17〕用重組小鼠粒細胞集落刺激因子(rG-CSF)治療非中性粒細胞減少的急性播散性念珠菌病小鼠，發現rG-CSF能增加粒細胞的抗真菌活性并把它們招募到感染的部位。因此，感染小鼠的死亡率明顯減少，腎、肝及脾臟的真菌的生長也顯著減少；同時，在非中性粒細胞減少的侵襲性念珠菌病患者中做了一項隨機安慰劑對照的臨床試驗，他們用氟康唑聯合G-CSF治療患者后發現，和對照組(氟康唑)相比，實驗組能更快的控制感染，并且無毒副作用。

巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)對中性粒細胞的功能沒有影響，但能促進單核細胞髓系祖細胞的增殖和分化，并能增強單核細胞和巨噬細胞的細胞毒性、吞噬作用、超氧化物產生、趨化細胞因子和繼發性細胞因子的產生。Kuhara等〔18〕發現對侵襲性白色念珠菌感染的小鼠給予兩性霉素B(AMPH-B)和hM-CSF聯合治療后能增強巨噬細胞和中性粒細胞的抗真菌活性，導致小鼠的生存期顯著延長。所以，他們希望AMPH-B和hM-CSF的聯合治療能提高AMPH-B的療效和減少抗真菌藥物的劑量。同時，一個臨床試驗也顯示，與歷史對照組相比，接受hM-CSF作為輔助治療的侵襲性念珠菌感染的骨髓移植患者(其卡氏評分>20%)，其生存率也顯著提高。

2.3炎性細胞因子單獨使用抗真菌藥的效果并不理想，但促炎細胞因子的使用有助于增加機體的抗真菌反應〔19〕。在急性膿毒癥時炎性細胞因子以勢不可擋之勢從機體中釋放，而在系統性念珠菌病時低得多。許多炎性細胞因子參與機體的抗真菌反應，如IL-1、IL-17、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)等。但是，ILs和TNF易引起膿毒癥樣綜合征，導致嚴重的全身性的副作用。相比之下，IFN-γ更適合作為侵襲性真菌感染的免疫調節因子〔20〕。

Kullberg等〔17〕對急性播散性念珠菌感染的小鼠給予IFN-γ治療后，發現小鼠中性粒細胞殺菌能力增強，小鼠腎、肝及脾臟的真菌量也減少。Pappas 等〔21〕對艾滋病相關的急性隱球菌性腦膜炎的患者使用rIFN-γ1b后發現，和對照組比較，rIFN-γ1b組能更快速地清除腦脊液中的真菌，并且無明顯得不良反應。最近，Armstrong-James等〔22〕也發現，在腎移植的侵襲性真菌感染的患者中用IFN-γ作為輔助免疫治療是有益的。他們招募了臨床上7個腎移植并患有侵襲性真菌感染的患者，這7個患者都對傳統的抗真菌藥耐用，當給予IFN-γ作為輔助免疫治療后，發現挽救了患者的生命，維持了移植的腎功能，長期隨訪無感染復發，且無明顯的毒副作用。雖然，這些研究證明IFN-γ作為侵襲性真菌感染的輔助治療是有效的，但仍需要臨床實驗進一步證明IFN-γ作為侵襲性真菌感染的輔助治療是否真的有效。

TNF-α是一個促炎細胞因子，在抗真菌感染的先天免疫和適應性免疫中起著重要作用。它能刺激中性粒細胞和巨噬細胞對白色念珠菌、煙曲霉和新生隱球菌的抗真菌作用，同時也能誘導其他細胞因子的產生，如IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ等〔23〕。有學者在新生隱球菌動物模型中證明，TNF-α能引發保護性的Th1免疫反應；在侵襲性肺曲霉病的動物模型中也發現，TNF-α的消耗會導致小鼠真菌菌量和死亡率的增加。

IL-12是由活化的巨噬細胞產生的一個重要的促炎細胞因子，并且能促進IFN-γ的產生。IL-15和IL-18也參與侵襲性真菌感染的固有免疫或適應性免疫反應。IL-15參與抗真菌固有免疫反應，通過提高抗真菌中性粒細胞或單核細胞活性；IL-18參與抗真菌Th1反應。

IL-4是一個參與抗真菌感染的Th2反應的細胞因子，它也能抑制白色念珠菌感染時單核細胞和巨噬細胞的吞噬活性。Pina等〔24〕在肺副球孢子菌感染的小鼠動物模型中證明，IL-4通過抑制Th1免疫反應及IFN-γ的產生，引起機體損傷。IL-10也能抑制單核細胞或中性粒細胞的抗真菌作用，在侵襲性念珠菌感染的模型中，IL-10也能抑制先天性和適應性Th1抗真菌反應。

2.4過繼免疫治療DC是一種功能強大的專職抗原遞呈細胞，是機體發生固有免疫和適應性免疫的橋梁。DC疫苗的開發雖處于早期階段，但目前臨床上已有DC腫瘤疫苗用于腫瘤患者的治療〔25〕。同時，這個概念也被用于微生物抗原，包括真菌抗原。Perruccio等〔26〕認為DC疫苗引發Th反應主要依靠一個形態型特異性的方式，單細胞真菌形式(酵母和分生孢子)和相應的真菌RNA誘導保護性的Th1反應，而真菌菌絲則誘導非保護性的Th2反應。有研究給念珠菌感染的小鼠皮下注射DC疫苗 (DC pulsed with Candida yeasts or yeast RNA)后，發現小鼠體內有IFN-γ產生，引起Th1反應；但如果是靜脈注射DC疫苗的話就很少甚至不會引起Th1反應，這說明了DC疫苗引發小鼠機體的反應與其傳遞方式有關。靜脈注射DC疫苗主要定植在網狀內皮系統和肺，而皮下注射主要位于淋巴系統。也有研究在煙曲霉感染的小鼠中給予DC疫苗皮下注射后，同樣會引發Th1反應，同時組織煙曲霉的菌量也會減少。

目前，也有大量的研究證明小鼠和人的自然殺傷細胞(NK)在體外對多種真菌都有抗菌作用。Bouzani等〔27〕在體外研究人類NK細胞與煙曲霉的相互作用時發現，NK細胞通過引起IFN-γ的釋放直接損害真菌。Park等〔28〕也在中性粒細胞減少的侵襲性曲霉病小鼠模型中證明，NK細胞的保護作用來源于IFN-γ早期的釋放，釋放的IFN-γ能增加巨噬細胞的抗真菌活性，引起肺組織中干擾素誘導的趨化因子的釋放。其早期階段NK細胞是肺組織中IFN-γ最重要的來源，活化的NK細胞的轉移有助于更快速的清除肺組織中的曲霉菌。

Cenci等〔29〕對侵襲性肺曲霉病的小鼠給予CD40+細胞過繼轉移后，小鼠的生存期延長。而一般情況下CD80+T細胞對真菌和其他感染的保護作用取決于CD40+T細胞的幫助。

3結論

輔助免疫治療是一種合理的新的治療方法，它的主要目的在于改善患者對侵襲性真菌感染的免疫機制。吞噬細胞系統參與了侵襲性真菌感染的重要防御，輔助免疫治療能增加效應細胞的抗真菌活性。雖然，一些動物實驗和臨床前研究已證明輔助免疫治療對侵襲性真菌感染是有效的，但尚缺乏臨床實驗來證明這一點，在這方面值得進一步深入研究。

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〔2014-11-20修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：孫航(1970-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事感染與免疫的研究。

基金項目：國家自然科學基金(No.81171543)

中圖分類號〔〕R329〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6921-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.127