肝星狀細胞在逆轉肝纖維化中的作用

徐天華，陳金鈴，朱丹丹，呂 蕾，段義農

肝星狀細胞在逆轉肝纖維化中的作用

徐天華，陳金鈴，朱丹丹，呂 蕾，段義農

肝纖維化是一種能夠導致門靜脈高壓、肝硬化、肝衰竭的嚴重疾病。已經發現肝星狀細胞的活化是引起肝纖維化的中心環節，因此抑制肝星狀細胞的活化、加速肝星狀細胞的清除有望逆轉肝纖維化。本文將對活化的肝星狀細胞的凋亡、衰老以及清除的研究進展作綜述，闡明肝星狀細胞在肝纖維化過程中所起的作用及相關機制。

肝纖維化逆轉；肝星狀細胞；凋亡；衰老

肝臟受到各種致病因子侵襲后會引起肝損害和炎癥反應，機體會對慢性肝損傷進行修復。若這種修復過程過度或失控就會引起肝內細胞外基質過度沉積，導致肝臟結構、肝功能發生異常，最終形成肝纖維化。肝纖維化是最嚴重的肝臟疾病之一，可由肝炎病毒、過量飲酒、非酒精性脂肪肝炎所誘導，最終導致門靜脈高壓、肝硬化、肝衰竭以及增加患肝癌的機率[1]。因此，對于尋找逆轉肝纖維化的途徑非常必要。

1 肝纖維化與肝星狀細胞

纖維化過程中，間葉樣成纖維細胞會遷移到傷口區域合成基質蛋白，導致細胞外基質過度增生、異常沉積。肝纖維化中的間葉樣細胞即肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)，是肝纖維化過程中主要的效應細胞和細胞外基質的主要來源。HSCs，又稱伊東細胞或貯脂細胞，位于Disse間隙內，緊貼著肝細胞和肝竇內皮細胞。HSCs可通過自身突觸與相鄰近的肝細胞、肝竇內皮細胞及神經末梢細胞相互接觸。正常情況下HSCs是靜止的，它形態較小且胞內含有脂質顆粒。在肝竇狀間隙微環境中，HSCs能夠生成多種細胞外基質，介導細胞間的接觸，并在促進血管生成、調控氧化應激反應方面發揮著重要的作用[2-3]。

但當肝臟受到一系列的慢性損傷，靜止的HSCs會被激活，活化的HSCs變得大而扁平，失去了儲存脂質顆粒的能力，能合成大量的細胞外基質、分泌許多促炎癥、促纖維化的細胞因子。同時活化的HSCs會轉化成肌成纖維樣細胞，增強細胞分泌膠原的能力并促使更多的細胞遷移到壞死、炎癥區域[4]。HSCs促進肝纖維化不僅由于細胞數量的增加，而且增加了細胞外基質的產生。細胞外基質的沉積損傷了肝細胞、破壞了它們的結構與代謝功能，加劇了肝纖維化，最終會導致肝衰竭、肝硬化等疾病[1]。

2 肝星狀細胞的活化

HSCs的活化是指靜止的HSCs轉變為肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)的過程。在肝臟微環境中，多種因素參與了HSCs的活化，這些因素包括理化因素、多種細胞因子、調節性蛋白及細胞外基質等。

乙型肝炎病毒、原發性硬化性膽管炎、酒精濫用及藥物代謝過程中的毒性產物超標等均可以造成肝細胞的損傷，損傷的肝細胞會釋放啟動肝星狀細胞活化的生長因子，激活靜止的肝星狀細胞轉化形成MFB，分泌大量的細胞外基質，最終導致纖維化[1]。

多種細胞因子在HSCs活化的各階段發揮著重要的作用。肝細胞損傷產生的轉化生長因子-α(TGF-α)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、內皮素-1(ET-1)等細胞因子在炎癥前期可以促發HSCs活化；在炎癥期，庫普弗細胞被激活,釋放TGF-β1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)進一步的激活HSCs，促進細胞增殖及轉化為MFB；炎癥后期MFB自分泌TGF、血小板源生長因子(PDGF)等細胞因子使活化得以持續,甚至去除啟動因素(肝細胞損傷)后纖維化進程仍持續[1-2,5]。

PPARs(peroxisome proliferator-activated receptors)是新近發現的能夠調節HSCs活化的重要的蛋白分子，在維持肝臟的穩態過程中發揮著關鍵的作用。它有三種亞型：α，β和γ，HSCs僅表達γ亞型。PPAR-γ對于調控HSCs活化起著重要的作用。體外培養的HSCs，通過誘導PPAR-γ蛋白或mRNA的表達，從而抑制HSCs增殖，有助于維持HSCs的靜止狀態。但當PPAR-γ表達下調或失活時則會導致HSCs的活化和肝纖維化的發生[6-7]。

細胞外基質具有多重的生物學特性，除了具有保護、抗壓、連接等物理學作用以外，也參與細胞的活化過程。細胞外基質的過度沉積一方面會損傷肝細胞，釋放啟動肝星狀細胞活化的生長因子；另一方面會激動HSCs細胞膜上的受體，例如整合素(integrin)，在integrin α β/FAK(局部黏著斑激酶，focal adnesion kinase)信號通路被激活后可通過整合、拆卸黏著斑促使HSCs的活化[1]。同時由于HSCs的激活又會合成大量的細胞外基質，從而進一步活化HSCs。

3 肝纖維化具有可逆性

肝纖維化的發生與發展受多種調控機制的影響[1]。自Katz等(1966)在曼氏血吸蟲病患者中發現肝纖維化逆轉現象后，人們改變了過去肝纖維化“不可逆轉”的觀點。許多學者通過大量的嚙齒目動物研究證實，肝臟發生纖維化病變后，纖維性的細胞外基質發生重構，肝臟中接近于正常肝結構的組織重新再生。同時，大量臨床數據也支持肝纖維化發生逆轉的可能[8-9]。肝纖維化的逆轉主要通過阻斷由端肽介導的膠原與膠原之間的相互作用[10]，抑制上皮細胞通過上皮-間質轉化途徑轉變為MFB[11]，刺激NK細胞殺傷毒性[12]等途徑，從而抑制HSCs的活化、增殖，增加活化HSCs的清除及膠原纖維的降解等，最終減輕肝纖維化。其中減少活化的HSCs數量及抑制其活性是實現肝纖維化逆轉的重要途徑。它通過誘導活化HSCs衰老[13]、促進活化的HSCs凋亡[14]以及增強免疫細胞對活化的HSCs清除[15]而實現。

4 HSCs細胞衰老與肝纖維化

細胞衰老是指細胞增殖出現不可逆的停滯。當細胞發生衰老時，細胞能維持活力代謝活動，但對于有絲分裂原的刺激則處于增殖失能狀態[16]。與細胞衰老相關的調控途徑主要有p16-pRb途徑，p53-p21-pRb兩條途徑，其中p53 和pRb 基因是兩條調控途徑的核心，在誘導與維持細胞衰老中起著關鍵作用[17-18]。在肺纖維化及腎纖維化研究中，細胞衰老一定程度上抑制了纖維化的發生及發展[19]。Krizhanovsky等在研究肝纖維化時發現，表達細胞衰老重要標志物細胞衰老相關β-半乳糖苷酶 ( senescence-associated β-galactosidase，SA-β-GAL) 的區域，肝纖維化重要標志物α-SMA 的表達則降低，ECM 沉積明顯減少。在細胞衰老相關基因p53 及INK4a/ARF分別敲除的肝纖維化小鼠模型中，肝臟纖維化明顯加重。當p53及INK4a/ARF同時敲除后，HSCs喪失衰老的能力，結果導致α-SMA表達上調，肝臟纖維化面積顯著增加。而在特異性干擾肝臟HSCs p53表達的轉基因小鼠纖維化模型中，HSCs的p53表達受到抑制，HSCs增殖活性(Ki67+α-SMA+)增強，從而導致肝纖維化明顯加重[10]。在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中， Xiaoni Kong[20]等人發現IL-22通過活化STAT3-SOCS3-p53信號通路可誘導HSCs的衰老，活化HSCs的衰老最終限制了小鼠的肝纖維化。這些結果提示衰老的HSCs能限制肝纖維化進程，有望實現肝纖維化的逆轉[21]。

此外，衰老 HSCs能激活參與免疫監視基因的表達。一方面能減少纖維化相關蛋白的分泌，同時也能降解已存在的纖維化相關蛋白；另一方面能增強機體免疫清除功能，從而減少活化的HSCs數量[22-23]。活化的HSCs衰老后，HSCs表面配體分子ULBP2表達增加，通過與NK細胞表面受體NKG2D相結合，激活NK細胞的免疫清除功能，加速衰老HSCs的清除，最終能夠逆轉肝纖維化[15,24]。

5 HSCs的凋亡與肝纖維化

細胞凋亡通常是指細胞自主有序的死亡，是自體損傷現象。纖維化肝臟中沉積的大量細胞外基質源于活化的HSCs。通過誘導HSCs凋亡，可減少活化HSCs的數量以及降低肝臟中膠原和組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的表達量，從而逆轉肝纖維化[14]。因此，除了HSCs衰老以外，促進HSCs凋亡成為另一個有效地逆轉肝纖維化的方法。

HSCs凋亡主要是由線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑所介導，并最終由caspase酶家族執行凋亡過程[25]。另外，其它一些信號通路被發現也能調節HSCs的凋亡。腫瘤壞死因子誘導凋亡相關配體受體-2 (TRAIL-R2)在肝細胞中不表達，卻在活化的HSCs中特異性表達增加。這使得HSCs更容易發生TRAIL所介導的凋亡，拮抗TRAIL-R2的抗體能夠選擇性的誘導HSCs的凋亡，抑制肝纖維化的過程[26]。此外， 活化NF-kB信號通路能夠抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)所誘導的活化HSCs的凋亡；相反，抑制NF-kB相關信號通路，會增加HSCs凋亡的比率，產生潛在的抗纖維化作用[27]。有研究發現：四甲基吡嗪能夠通過誘導p53活化，促進HSCs的凋亡，從而逆轉肝纖維化[28]。此外，我們之前的研究也證明p53在調節HSCs凋亡中發揮著重要的作用, 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigens, SEA)能夠通過增加p53的表達誘導HSCs的凋亡從而逆轉肝纖維化[29]。

6 HSCs免疫清除與肝纖維化

肝臟微環境中，多種免疫細胞參與了活化HSCs的清除，實現了肝纖維化的逆轉，這些細胞包括自然殺傷細胞(NK)、庫普弗細胞(KC)、T淋巴細胞和自然殺傷T細胞(NKT)。

肝纖維化過程中NK細胞具有特異性的保護作用，它能夠選擇性殺死活化的HSCs，對于早期活化的HSCs或衰老的HSCs尤為敏感。體外共培養NK細胞和HSCs， NK細胞可直接作用于HSCs，導致HSCs發生凋亡的數目增加。之前有研究者發現，使用聚肌胞甘酸(Poly(I:C))或IFN-γ能夠增加NK細胞活化受體NKG2D的表達，而NKG2D可以與HSCs上配體分子ULBP2結合，從而激活 NK細胞的免疫清除功能，增強NK細胞對活化HSCs的細胞毒性[30]。STAT1(信號傳導與轉錄活化因子1)在NK細胞對活化的HSCs清除過程中發揮著關鍵作用。在STAT1敲除的小鼠模型中，NK細胞對HSCs殺傷作用顯著減弱。這可能是由于STAT1的敲除，下調了NK細胞中NKG2D的表達，從而影響了NK細胞的免疫清除功能[31]。

KC細胞是一類存在于肝竇狀隙的巨噬細胞，正常情況下具有非特異性殺傷作用。然而在肝纖維化形成過程中，它能夠誘導活化HSCs凋亡以及細胞外基質的降解[32]。KCs細胞通過激活caspase級聯反應和分泌相關誘導凋亡的腫瘤壞死因子來促進HSCs的凋亡、抑制HSCs的增殖[33]。此外，KCs細胞還能有效地抑制HSCs內組織金屬蛋白酶抑制劑的表達，通過分泌炎癥抑制因子IFN-γ、IL-10促使細胞外基質的降解，最終導致活化HSCs數量的減少，從而逆轉肝纖維化[34-35]。

在乙型肝炎和丙型肝炎病人體內，CD4+/CD8+的比率會明顯減少且肝臟纖維化形成的速度會加快[36]。由此，人們提出T淋巴細胞可能參與調節肝臟纖維化的過程。CD4+T細胞能夠分化成不同類型的輔助性T細胞, 調節不同的免疫反應。Th1細胞分泌的IFN-γ能夠限制HSCs的活化、增殖，誘導細胞凋亡[37]。另外，調節性T細胞(CD4+CD25+T cells)能夠限制NK細胞的活化，減弱NK細胞對HSCs的清除作用[38]。

NKT細胞是個獨特的T細胞異質群體，IL-30可以上調它的活化受體NKG2D的表達，而NKG2D可以與HSCs上配體分子Rae1結合，激活NKT細胞的免疫清除功能[38]，直接殺死活化的HSCs，發揮抗纖維化的作用。

7 結 語

肝纖維化嚴重地威脅著人類的健康，因此研究逆轉肝纖維化的分子機制顯得尤為重要。HSCs的活化是導致肝纖維化的中心環節。抑制HSCs活性、加速HSCs的清除有望逆轉肝纖維化。誘導活化的HSCs發生衰老、凋亡能夠限制促纖維化細胞因子及膠原的分泌；同時，多種免疫細胞參與活化HSCs的清除，從而減少活化HSCs的數量。因此，探討誘導活化的HSCs發生衰老、凋亡及加速活化的HSCs清除的分子機制，對于尋找逆轉肝纖維化的潛在靶點具有重要意義。

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Effect of hepatic stellate cells in liver fibrosis regression

XU Tian-hua,CHEN Jin-ling,ZHU Dan-dan,LU Lei,DUAN Yi-nong

(DepartmentofPathogenBiology,SchoolofMedicine,NantongUniversity,Nantong226001,China)

Liver fibrosis is considered as a serious disease, which can lead to portal hypertension, liver cirrhosis and liver failure. It has been well established that the activation of hepatic stellate cells plays a vital role in the hepatic fibrosis. Inhibiting hepatic stellate cells activation and accelerating clearance of hepatic stellate cells are promising strategies against liver fibrosis. In this assay, apoptosis, senescence and the clearance of the activated hepatic stellate cells will be reviewed, which aims to demonstrate the effect of hepatic stellate cells and its mechanism in hepatic fibrosis regression.

liver fibrosis regression; hepatic stellate cells; apoptosis; senescence

s: Chen Jin-ling, Email: chenchennt@126.com; Duan Yi-nong, Email: yinongduan@aliyun.com

國家自然科學基金項目(No.81471975, 81171589, 81401683)，江蘇省自然科學基金項目(No.BK20140435)，江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)以及南通大學研究生科技創新計劃項目(No.YKC15054)聯合資助

陳金鈴,Email:chenchennt@126.com; 段義農,Email:yinongduan@aliyun.com

南通大學醫學院病原生物學系，南通 226001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.017

R372

A

1002-2694(2015)11-1065-04

2015-07-12；

2015-08-21

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81471975, 81171589, 81401683), the Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (No. BK20140435), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) and the Graduate Student Research and Innovation Program of Nantong University (No. YKC15054)