多重PCR和間隔區寡核苷酸分型技術應用于不同流行地區的牛結核病研究

張喜悅，范承祥，杜鵬飛，曹 瑞，呼西旦，王淑娟，范偉興

多重PCR和間隔區寡核苷酸分型技術應用于不同流行地區的牛結核病研究

張喜悅1，范承祥2，杜鵬飛1，曹 瑞1，呼西旦3，王淑娟1，范偉興1

目的 在牛結核病監測中聯合應用菌株的多重PCR鑒定和間隔區寡核苷酸分型(spoligotyping)，快速鑒定分離菌株并分析不同地區流行菌株的特點。方法 分別在牛結核病清凈地區和流行地區進行牛型PPD變態反應試驗，撲殺陽性牛后進行病理檢查，并采集病料分離細菌。獲取分離菌株，進行多重PCR鑒定和spoligotyping分型，分析不同地區的菌株特征。結果 結核病清凈地區監測到16頭牛型PPD陽性牛，撲殺后未見有病變，采集病料分離到4株分枝桿菌，經多重PCR鑒定均為非典型分枝桿菌。流行地區監測牛型PPD陽性23頭，撲殺后發現14頭有病變，采集病料后共有11頭分離到疑似菌，經多重PCR鑒定均為牛型分枝桿菌。用spoligotyping分析共分為4個型，其中2個為未見報道的新型，報英國AHVLA牛結核spoligotyping數據庫后獲取通用編號SB1903和SB1904。結論 分離菌株中的優勢菌株為首次報道的SB1903，但也檢出有國際流行菌株SB0140，證實該地區牛結核病的流行是以“獨特菌型地域內相互傳播為主、輸入性感染為輔”為特征。本次監測發現國內有SB0140菌株分布，提示應調查該型菌是否已經傳染至我國人間。

牛結核；多重PCR；間隔區寡核苷酸分型

Supported by the National Basic Research Program of China (No. 2012FY111000) and the China Agriculture (Dairy) Research System (No. CARS37) Corresponding author: Fan Wei-xing, Email: fwxsjl@126.com

牛結核病主要是由牛結核分枝桿菌引起的一種人獸共患病。確診牛結核病的關鍵是能夠分離到并準確鑒定病原。傳統的牛結核分枝桿菌鑒定方法主要包括細菌形態、染色特性和生化鑒定等，這些鑒定方法操作復雜且需時較長。根據比較基因組學的原理，Wilton等[1]建立了可以鑒定多種分枝桿菌的分枝桿菌多重PCR并在世界范圍內得到了廣泛的應用。近年來也出現了一些新的基因分型技術，可以從分子水平上分析不同地理區域流行的牛型分枝桿菌的特點、追蹤傳染源，對于了解牛結核分枝桿菌的生態分布與傳播，以及時提出預警等，都具有重要的意義。目前國內外應用于結核分枝桿菌復合群基因分型方法主要分為兩類：一類是以限制性片斷長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)為基礎的方法[2]，另一類是以基因組中特定多態性區域序列進行PCR擴增為基礎的方法，其中的間隔區寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, spoligotyping)分型方法已經被廣泛用于牛結核分枝桿菌的分型，是第一個被認可的分型方法[2-6]。

我國目前的變態反應陽性牛均要求撲殺，但很多變態反應陽性牛并不能見到結核癥狀，且撲殺后沒有明顯的病變。根據我們前期的研究，牛結核變態反應試驗在流行率較低的地區假陽性相對較多，而在流行率較高的地區則相對較少[7]。我們在前期工作的基礎之上，分別撲殺在不同流行率地區檢出的變態反應陽性牛并進行細菌分離，用多重PCR方法鑒定和spoligotyping方法分型，并評估這兩種方法在不同地區的應用價值。

1 材料和方法

1.1 試劑和重要儀器 Taq DNA聚合酶(5U/μL)、PCR Master等購自于大連寶生物公司。DNA Marker 、EB(溴化乙錠)等購于Promega公司。Middle brook 7H11培養基，購自美國BD公司。Rnase A、蛋白酶購自大連寶生物公司。Spoligotyping 試劑盒購自Ocimum Biosolution，ECL 發光檢測試劑購自Amersham International公司，親核素—過氧化物酶連接液購自Boehringer公司。顯影液和定影液均購自柯達公司。Mini-blotter MN45 為荷蘭Isogen Life Science 公司產品。多重PCR引物Mycgen、 TB1 、Mycav、Mycint 4和spoligotyping引物DRa、DRb均由大連寶生物公司合成。多重PCR引物序列參考文獻；DRa序列為5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，5′末端采用Biotin標記；DRb序列為 5′ -CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。

1.2 標準菌株 結核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97、BCG-Pasteur標準株、禽分枝桿菌標準株、胞內分枝桿菌標準株和草分枝桿菌標準株，均由北京市結核病胸部腫瘤研究所細菌免疫研究實驗室提供。

1.3 疫區和非疫區結核陽性牛的剖檢 地區1歷史流行率高于2%的3個結核陽性牛牛場，共計114頭牛，在檢疫后發現23頭陽性牛；來源于歷史流行率低于0.5%的地區2的1個牛場，共計312頭牛，經檢疫后發現16頭陽性牛。將陽性牛剖殺后檢查病變，有病變的采集結核結節，無病變的采集淋巴結。

1.4 分枝桿菌的培養及染色鑒定 無菌條件下，采集結核病變，加入適量的滅菌生理鹽水，經研磨器勻漿處理后，加入2倍體積的4%硫酸，室溫下處理病料15～20 min。利用生理鹽水再將處理過的病料做10倍稀釋，用移液器分別接種0.2 mL至Middle brook 7H11 培養基。37 ℃培養6周，將擴大培養好的臨床分離菌株和牛結核分枝桿菌標準株轉移到密閉的含有生理鹽水的試管中，將試管置于水浴鍋，經80 ℃ 2 h滅活。用Ziehl-Neelsen(Z-N)方法染色，于顯微鏡下觀察結果。

1.5 分離菌株的分枝桿菌多重PCR鑒定 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，用Mycgen、 TB1 、Mycav和Mycint 4對引物進行擴增，擴增出1 030 bp片段表明為分枝桿菌種，擴增出372 bp片段為MTC群(包括人分枝桿菌和牛分枝桿菌等)。如果只擴增出1 030 bp片段而沒有372 bp片段則為非結核分枝桿菌。

1.6 spoligotyping鑒定分離菌株 采用Kamberbeek J推薦Spoligotyping方法并做適當改進[8]。

1.6.1 PCR擴增直接重復區(DR區) 用結核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株的DNA為陽性對照，以DRa和DRb作為引物。對臨床分離株的DNA進行PCR擴增。反應體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物(10 pmol/L) 各2 μL、模板DNA 2 μL、雙蒸水8.5 μL，總體積25 μL。反應程序為96 ℃預變性3 min，96 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s 30個循環，72 ℃延伸7 min。

1.6.2 PCR 產物的雜交與檢測 將25 μL PCR產物加入到175 μL 2×SSPE/0.1% SDS中，100 ℃ 水浴10 min，取出立即放入冰上。用250 mL的2×SSPE/0.1% SDS在60 ℃洗雜交膜5 min，將雜交膜放入miniblotter , 并使狹縫和寡核苷酸的線型模型相垂直。將稀釋的PCR產物填入狹縫，并用防水膠帶將miniblotter密封，放置于60 ℃水浴鍋的水平表面雜交60 min。洗膜并晾干放入保鮮袋中冷卻，加入10 μL親核素-過氧化物酶連接液42 ℃孵育60 min。洗膜后加入ECL液并曝光10 min、顯影5 min，定影5 min，清洗膠片。

2 結 果

2.1 疫區和非疫區結核陽性牛的剖檢結果 地區1的3個歷史結核陽性牛場的共計23頭陽性牛；其中群1剖殺9頭，有6頭有結核病變；群2剖殺11頭，7頭發現結核病變，群3剖殺3頭，1頭發現結核病變；采集結核病變或淋巴結至實驗室進行細菌分離。其中部分病變見圖1。地區2牛場檢出的陽性牛共計16份，剖殺后未發現病變，采集淋巴結至實驗室進行細菌分離。

A: Tubercle on lung of PPD positive cattle; B: Pearl-like tubercles on chest wall of PPD positive cattle.

圖1 PPD陽性牛解剖后發現的結核病變

Fig.1 Tubercles formed in the chest of the skin test reactor

2.2 細菌分離結果 將結節內的干酪樣壞死取出，或者將淋巴結勻漿后經酸處理，接種于Middle brook 7H11培養基。37 ℃培養6周，培養陽性者可見有不透明的顆粒狀菌落生長，表面皺褶粗糙，呈乳白色結節狀，陰性則無菌生長。結果地區1的23份病料中，14份病變組織中有9份分離到可疑菌，9份非病變淋巴結中有2份分離到可疑菌，從病料中分離到細菌的幾率為47.8%(11/23)；地區2的16份病料中，4份分離到可疑菌，從病料中分離到細菌的幾率為25%(4/16)。

2.3 分枝桿菌多重PCR鑒定結果 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，以草分枝桿菌作為陰性對照進行分枝桿菌多重PCR。反應結束后取5 μL產物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統上觀察。結果陽性、陰性對照均成立，牛結核疫區的臨床樣品分離菌株同牛分枝桿菌標準株一樣，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1 030 bp片段擴增，引物TB1-F和TB1-R有372 bp片段擴增，而非結核疫區的陽性牛分離菌株則僅有1 030 bp片段擴增，沒有372 bp片段擴增(見圖2)。證實地區1的臨床樣品分離菌株屬于MTC群，而地區2的臨床樣品分離菌株則為非結核分枝桿菌。

1: DNA Marker; 2:MycobacteriumbovisAF2122/97; 3:Mycobacteriumphlei; 4-7: Pathogens isolated from higher prevalence area were identified asM.tuberculosis-complex (MTC); 8-11: Pathogens isolated from lower prevalence area were identified as nontuberculoaus mycobacteria (NTM).

圖2 污染牛群和非污染牛群結核陽性牛病料分離菌株的多重PCR鑒定結果

Fig.2 Multi-PCR identification of mycobacterium isolates from several areas of China

2.4 spoligotyping分型結果 應用spoligotyping分型技術對牛分枝桿菌臨床分離株、結核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株進行鑒定。其中結核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株的雜交圖譜與國際報道的標準一致。牛分枝桿菌臨床分離株均缺失39～43之間的雜交，符合牛分枝桿菌的特點。

Spoligotyping可將臨床分離的牛分枝桿菌分為4個基因型(見表1)。通過查詢國際牛結核分枝桿菌spoligotyping數據庫(http://www.mbovis.org/ spoligodatabase)，4個型中的2個型國外已有報道，分別為SB0140(世界范圍內流行)[9-13]、SB1694(意大利有報道，參見數據庫)；另有2個型國際上尚無報道，我們將這2個型的數據提交數據庫，獲取其統一編號為SB1903和 SB1904。SB1903型菌株Spoligotyping圖譜缺失3、9、16、26、28和39-43號間隔區，SB1904型菌株Spoligotyping圖譜缺失3、4、9、16、26和39-43號間隔區，其共同特點是缺失26號間隔區(牛結核分枝桿菌均缺失3、9、16、39-43號間隔區)，該特點可能是地區1流行的牛結核分枝桿菌菌株特征。

3 討 論

3.1 多重PCR和Spoligotyping在我國牛結核監測中的應用價值 我國應用較多的牛結核病檢測方法(頸部變態反應)的特異性較低(88.8%～100%)，國際上已被認可的γ干擾素試驗仍然具有較高的非特異性(3.4%)[14]，用這些方法監測牛結核病會產生很高的非特異反應，因此必須聯合使用細菌的分離與鑒定方法(特異性100%)才能提高監測的準確性。但由于細菌分離鑒定過于繁瑣，常規的生化試驗如噻吩-2羧酸肼培養基生長試驗、硝酸還原試驗和煙酸試驗等方法復雜，需時較長，且具有生物風險，在我國牛結核監測的實踐中很少有應用。國際上病原鑒定中廣泛應用的多重PCR方法和spoligotyping方法在我國的應用極少，本實驗嘗試聯合應用這兩種方法鑒定牛結核分枝桿菌，簡便快速且能進行分子流行病學分析，促進我國牛結核病監測的范圍和準確性提升。

3.2 流行率不同地區的分離菌株的不同 地區1(流行率較高地區)一共23頭牛，撲殺后有14頭有病變，共有11頭牛分離出可疑菌，經多重PCR鑒定均為牛結核分枝桿菌；而地區2(流行率較低地區)撲殺16頭牛，均沒有發現病變，細菌分離僅有4份病料分離出非特異性分枝桿菌。本實驗在牛結核流行率較高的地區，變態反應陽性牛撲殺后發現病變的幾率(60.9%)，以及從病料中分離到可疑菌的幾率(47.8%)，高于流行率較低地區(分別為0%和25%)。這也從側面證實，在牛結核清凈地區的檢疫過程中，會產生較高的假陽性或者是非特異性分枝桿菌感染。這與我們前期的試驗結果一致且與理論相符，即在流行率較低的地區進行監測，檢測出來的陽性有很大一部分為非特異性反應，按照國標方法撲殺后必須要進行細菌分離與鑒定等工作以增加監測的準確性。

3.3 spoligotyping的應用價值 Spoligotyping在我國的應用較少，本次調查，發現地區1流行的主要菌型為SB1903。但其在獨特菌型在地區1優勢流行時，試驗涉及的3個牛場，均分離出了SB0140型菌，證實這株國際上廣為流行的菌株，也分布于該地區。證實該地區的菌株分布呈現出“獨特菌型地域內相互傳播為主、輸入性感染為輔”的特征。隨著國內牛結核分枝桿菌分離菌株的增多，不同地區將呈現出其當地的獨特型菌株分布。因此，根據不同地區不同牛分離菌株的spoligotyping分析結果，就可以追溯傳染源，并從分子水平上展開預警分析。

3.4 SB0140型牛分枝桿菌的公共衛生意義 SB0140型牛分枝桿菌廣泛分布在英國、澳大利亞、新西蘭、加拿大等世界范圍內，而且在這些國家的分離菌株中占有很大比例[9]。如Joanne McLernon[10]等對愛爾蘭的386株細菌進行spoligotyping分型，結果SB0140型約占50%；[11]等對來自于阿根廷、巴西、智利、墨西哥和委內瑞拉的1 684株牛結核分枝桿菌進行spoligotyping分型，結果SB0140所占比例最大，為24.6%。更值得關注的是，SB0140 具有重要的公共衛生意義。Olabisi Ojo[12]等報道，1998-2006年501位愛爾蘭人患者，有15位(3%)為人感染牛結核分枝桿菌， 分離的11株細菌中3株(27%)為SB0140型。Timothy C. Rodwell[13]等對美國的106例人感染牛結核分枝桿菌進行調查，91%的感染人的牛結核分枝桿菌spoligotyping分型結果與感染墨西哥牛的分枝桿菌分型結果一致，證實加州南部的牛結核分枝桿菌感染人病例與墨西哥牛相關，而這106人中有39人(36.8%)的牛結核分枝桿菌分型結果為SB0140型。本次在我國也發現了SB0140型在牛群中的感染，但至于該型菌是否存在于我國人的感染病例中，尚需進一步研究。SB0140型牛結核分枝桿菌的分離與鑒定，很顯然具有重要的公共衛生意義。

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Application of multiple-PCR and spoligotyping for investigation ofbovine tuberculosis from different epidemic areas

ZHANG Xi-yue1,FAN Cheng-xiang2,DU Peng-fei1,CAO Rui1,HU Xi-dan3,WANG Shu-juan1,FAN Wei-xing1

(1. China Animal Health & Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;2.Rizhao Animal Disease Control Center, Rizhao 276800, China；3.Veterinary Research Institute，Animal Science Academy of Xinjiang，Wulumuqi 830000，China)

To characterize theMycobacteriumbovisin the different epidemic areas, we combined the multiple-PCR and spoligotyping to investigate the bacteria isolated in the bovine tuberculosis surveillance. The bovine PPD skin tests were performed in lower-prevalence and higher-prevalence areas in China. The positives were slaughtered and their carcasses were examined for the tubercles. Isolated pathogens were identified by using multiple-PCR and then genotyped by using spoligotyping. No lesion was found from the carcasses of 16 positives in the lower-prevalence area. The 4 strainsMycobacteriawere isolated from the lymph nodes collected from the positives and then identified as nontuberculosisMycobacteriaby using multiple-PCR. The 23 positives were slaughtered and examined in the higher-prevalence area. The lesions were found from 14 cattle and then the pathogens were isolated from the 11 of them. The bacteria were identified asMycobacteriumbovisby using multiple-PCR. Totally, 4 spoligotypes were classified and 2 of them were new types. Number SB1903 and SB1904 were given after the patterns were submitted to the bovine tuberculosis spoligotyping database. It was revealed that the character of "domestic typing SB1903" was predominant but the world-spread typing SB0140 still be insistent in the area. It suggests that the scientists should pay attention on the transmission of the typing SB0140 to human beings as the typing has been found from cattle in China.

bovine tuberculosis; multiple-PCR; spoligotyping

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.010

范偉興，Email:fwxsjl@126.com

1.中國動物衛生與流行病學中心,青島 266032； 2.山東日照動物疫病預防控制中心，日照 276800； 3.新疆牧科院獸醫研究所,烏魯木齊 830000

R378

A

1002-2694(2015)04-0340-05

2014-02-14；

2014-10-20

科技基礎性工作專項(2012FY111000)，現代農業(奶牛)產業技術體系建設項目(CARS37)