湖北2013年部分柯薩奇A16型腸道病毒VP1基因分子特征分析

李 靜,占建波，楊朝暉,雷亞克,張 婷,李國明

湖北2013年部分柯薩奇A16型腸道病毒VP1基因分子特征分析

李 靜,占建波，楊朝暉,雷亞克,張 婷,李國明

目的 全面研究和了解2013年湖北省柯薩奇A16型的VP1基因特征，分析CVA16型病毒在我省的基因型別及分子進化分析。方法 對2013年湖北省21株CVA16病毒流行株進行VP1區全長基因序列測定，并對核苷酸及氨基酸序列進行同源性比較及系統進化分析。結果 2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1區核苷酸序列全長均為891 bp，VP1區核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分別為90.0% ～ 100.0 % 和96.3% ～100.0%。VP1區基因系統進化分析表明，湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上，分屬于B1a和B1b基因亞型。結論 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要為B1b基因亞型，其次為B1a基因亞型，在同一地區有兩種基因亞型的 CVA 16 病毒同時存在, 在不同的地區存在同一種亞型的CVA16病毒。

柯薩奇病毒CVA16型；VP1區；基因特征

手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發生于5歲以下兒童。引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，以柯薩奇病毒A16型(CVA16)和腸道病毒71型(EV 71)最為常見[1]。雖然CVA16與EV71型病毒在遺傳上有一定的相似性，但CVA16具有自己的遺傳特性和分子生物學特征。CVA16引起的手足口病癥狀較輕，較少有并發癥發生，但CVA16和 EV 71的共同流行常會導致比較嚴重的手足口病疫情[2]。

本研究根據2013年湖北省部分地區HFMD病原學監測結果，對CA16型病毒進行VP1基因序列測定和進化分析，了解CA16型病毒在湖北省的主要型別以及分子流行病學特點。

1 材料和方法

1.1 標本來源 采自湖北省2013年手足口病監測哨點醫院手足口病患兒的咽拭子、肛拭子、皰疹液標本。

1.2 病毒核酸提取 對手足口病標本病毒核酸直接進行提取，核酸提取采用Qiagen公司的Viral RNA Mini Extraction Kit提取，具體步驟見產品說明書。提取的RNA溶于50 μL RNase-free ddH2O中，于-70 ℃凍存備用。

1.3 CVA16病毒核酸陽性的鑒定 對送檢標本的核酸進行real-time RT-PCR檢測，對CVA16病毒核酸檢測陽性標本進一步進行VP1基因擴增。Real-time RT-PCR試劑盒購自江蘇碩世生物科技有限公司。

1.4 CVA16病毒VP1基因引物設計 對CVA16病毒核酸real-time RT-PCR檢測陽性的標本直接進行VP1基因擴增，VP1基因上下游擴增引物[3]分別為CVA16-VP1-S: 5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′ (nucleotides 2335 to 2354); CVA16-VP1-A: 5′-GCTGTCCTCCCACACAAGAT-3′ (nucleotides 3426 to 3445)。預期擴增片段長度約為1 100 bp。

1.5 CVA16病毒VP1基因RT-PCR擴增和測序 采用one-step RT-PCR方法進行VP1基因進行擴增。one-step RT-PCR Kit、Taq DNA聚合酶，dNTPs等均購自Takara公司。VP1基因擴增反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環, 最后72 ℃，7 min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠圖像分析系統進行分析。所得PCR產物直接進行序列測定(由上海生工完成)。

1.6 CVA16病毒VP1基因同源性和進化分析 將所測到的CVA16病毒的VP1序列與GenBank中其他CVA16病毒的VP1序列進行同源性比較和進化分析。序列分析和進化樹分析采用DNAStar MegAlign軟件和Mega5.0軟件。

2 結 果

2.1 VP1基因核苷酸同源性分析 對湖北省21株CVA16型流行株進行VP1基因核苷酸序列測定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列長度為891 bp，編碼297個氨基酸。利用DNAStar MegAlign軟件進行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對分析。21株CVA16毒株的核苷酸與氨基酸序列同源性分別為90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。21株毒株的VP1基因與A基因型代表株CVA16 G-10株VP1區核苷酸和氨基酸同源性分別為75.3%～76.9%、88.9-92.6%, 與B基因型各亞型B1a、B1b、B1c和 B2株VP1區核苷酸同源性比較結果見表1。

表1 湖北CVA16流行株與CVA16病毒不同基因型及亞型代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較

Tab.1 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Hubei and other different genotype (subgenotype) CVA16 strains on VP1 genes

▲CVA16 strains from Wuhan; △CVA16 strains from Shiyan; ■CVA16 strains from Huangshi; □CVA16 strains from Jingzhou; ○CVA16 strains from Xiantao; ●CVA16 strains from Xianning;◇CVA16 strains from Ezhou.

圖1 湖北CVA16流行株V P1全基因序列進化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis based on the alignment of the complete VP1 gene sequences of CVA16

2.2 CVA16毒株VP1基因分子進化分析 利用Mega5.0 軟件， 運用maximun-likelihood方法，根據CVA16病毒全長VP1基因核苷酸序列進行分子進化分析。湖北CVA 16 流行株分別與lineage1和lineage3代表株處于一簇(見圖1)，且與B1a 和 B1b 亞型代表株分別處于同一分支上(見圖2)。21株CVA16毒株分別來自于武漢(WH)、鄂州(EZ)、咸寧(XN)、十堰(SY)、荊州(JZ)、黃石(HS)和仙桃(XT)。從進化樹上可以發現，武漢、荊州和鄂州地區的CVA16毒株存在不同的基因譜系的CVA16毒株，以及不同基因亞型的CVA16毒株。

Fig.2 Phylogenetic and subgenotype analysis based on the VP1 gene sequences of CVA16 in Hubei Province, China

2.3 湖北CVA 16流行株的 V P1 區編碼蛋白變異位點分析 對21株湖北CVA16 流行株VP1區核苷酸序列推導出的氨基酸序列與CVA16 病毒 A、B1a、B1 b、B1c 和 B2基因型及亞型代表株VP1區的氨基酸序列進行比對分析，變異位點結果見表2。21株CVA16流行株與原型株 G 10之間的氨基酸變異位點進行比較，其中JZ144-HB-2013株變異位點較多。在第 23位氨基酸位點處，9株CVA16流行株發生L→M的突變，與B1a亞型代表株馬來西亞MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

3 討 論

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD) 是由腸道病毒引起的傳染病，引發HFMD的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)均為HFMD 較常見的病原體， 其中以柯薩奇病毒CVA16型和EV71最為常見[4]。CVA16病毒為單股正鏈RNA病毒，小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒為二十面體立體對稱球形結構，病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4 4種多肽組成，其中VP1、VP2和VP3位于衣殼表面，VP4位于病毒衣殼內部。VP1區長891bp，編碼297個氨基酸殘基，是病毒主要的中和抗原決定簇所在的部位，也是腸道病毒血清型的分型依據[5-6]。因此CVA16病毒VP1區核苷酸和氨基酸變異及分子進化分析，有助于了解湖北省CVA16型病毒的分子流行病學特征。

本研究對湖北省21株CVA16型流行株進行VP1基因核苷酸序列測定和分析，該21株CVA16毒株的VP1基因核苷酸與氨基酸序列同源性分別為90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。與A基因型代表株CVA16 G-10株VP1區核苷酸和氨基酸同源性分別為75.3%～76.9%、88.9%～92.6%,與B基因型各亞型B1a、B1b、B1c和B2株VP1區核苷酸同源性分別為91.4%～95.8%，91.2%～97.0%，90.7%～92.9%，87.9%～91.1%；氨基酸同源性分別為96.0%～100.0%，95.6%～100.0%，95.3%～99.0%，96.3%～100.0%。根據核苷酸和氨基酸序列同源性分析結果，可以看到CVA16病毒VP1區核苷酸變異雖大，但氨基酸同源性較高，推測存在一定的同義突變。對CVA16病毒VP1區氨基酸序列變異位點分析發現，僅JZ144-HB-2013株變異位點較多。在第23位氨基酸位點處，有9株CVA16流行株發生L→M的突變，與B1a亞型代表株馬來西亞MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

目前CVA16病毒基因分型主要有兩種方法，分別基于衣殼蛋白VP4區和VP1區核苷酸序列。Li等[7]根據CVA16病毒VP4核苷酸序列將CVA16分為A、B、C 三個分支。 Zhou等[8]根據VP1核苷酸序列對CVA16 病毒進行分型分析，將CVA16分為A和B兩個基因型，其中B基因型有進一步分為B1 (B1a和B1b)， B2以及B3基因亞型。主要為B1亞型，B1亞型又可以分為B1a和B1b兩個型別，B1a亞型主要為1999-2008年中國CVA16毒株，而B1b主要為2005-2006年的中國CVA16毒株，B2基因亞型主要為1999-2000年的中國CVA16毒株。根據進化分析的Bootstrap值(99%)以及與B1和B2亞型核苷酸序列的9.0%～13.4%差異，劃分出B3基因亞型。Perera[9]等分析CVA16原型株G-10與其它所有CVA16毒株的VP1全基因核苷酸序列的差異為27.7%～30.2%，將G-10株劃分為A基因型。而其它所有CVA16 毒株VP1核苷酸差異均低于13.4%，因此將其它所有CVA16毒株劃分為B基因亞型。 其中B基因亞型的CVA16毒株根據Bootstrap值(>99%)進一步分為兩個基因譜系lineages 1和2。根據CVA16病毒的基因型別之間VP1全基因序列的核苷酸差異至少為15%[9]，Zhang[3]等根據VP1核苷酸序列將中國CVA16毒株分為A和B兩個基因型，將B 基因型劃分為3個基因譜系lineage1、2和3，并根據核苷酸差異和進化分析進一步將B基因型分為B1和B2兩個基因亞型，B1亞型又分為B1a、B1b和B1c三個型別，其中B1a和B1b之間的核苷酸差異為6.5% ，B1c和B1a、B1c和B1b 之間的核苷酸差異分別為7.0% 和6.8%。Iwai[10]等將CVA16A、B和C三個型別，其中B和C分別相當于Zhang等學者劃分的 B2和B1亞型。Zhang等研究表明，中國1999-2008年的CVA16毒株主要為B1a和B1b基因亞型，同一時期在臺灣、馬來西亞、泰國、澳大利亞、越南以及沙特阿拉伯的CVA16毒株也分屬于B1a和B1b兩個基因亞型。這說明中國的CVA16毒株與上述地區及國家流行CVA16毒株是共同進化或流行。僅馬來西亞SB16087/MAL/2005)株單獨位于一個分支，形成B1c基因亞型。

Note:□The differences in amino acid sites

本研究根據Zhang等學者的分類方法，將湖北省21株CVA16毒株進行進化分析，發現湖北省CVA16毒株為B基因型，分別屬于lineage 1和3兩個基因譜系，基因型別分析分別為B1a和B1b基因亞型。在同一地區有兩種基因亞型的 CVA 16 病毒同時存在, 在不同的地區存在同一種亞型的CVA16病毒, 說明湖北省CVA 16病毒的B1a與B1 b兩種基因亞型共同進化與流行，主要流行的CVA 16 病毒為 B1b 基因亞型。

本研究對湖北省手足口病的 CVA 16流行株VP1基因進行核苷酸變異和分子進化分析, 了解湖北省CVA 16病毒的基因特征和流行情況, 為手足口病的防控提供了基礎資料。

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VP1 gene of Coxsackie virus A16 from Hubei Province, China, 2013

LI Jing,ZHAN Jian-bo,YANG Zhao-hui,LEI Ya-ke,ZHANG Ting,LI Guo-ming

(Hubei Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, China)

In order to investigate the genetic background of Coxsackie virus A16 (CVA16) in Hubei Province, China, the genetic characteristics of VP1 genes of CVA16 strains were analyzed in this study. The complete VP1 sequences of 21 CVA16 strains from clinical samples were amplified by one-step RT-PCR and sequenced to engage the homological and phylogenetic analysis. The full-length VP1 region of 21 CVA16 strains was 891 bp. The nucleotide and amino acid identity among the CVA16 strains were 90.0%-100.0% and 96.3%-100.0%, respectively. Phylogenetic analysis based on complete VP1 sequence also indicated that the 21 Hubei CVA16 strains were belonged to the lineage 1 and lineage 3 and further divided into subgenotype of B1a and B1b. The genotype of Hubei CVA16 strains were mainly B1b subgenotype followed by B1a subgenotype. In the same areas, two kinds of subgenotype of CVA16 co-existed and the same subgenotype CVA16 was prevalent in different areas in Hubei Province, China.

Coxsackie virus A16; VP1 gene; molecular characteristics

Li Guo-ming, Email:liguominghb@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.006

李國明，Email：liguominghb@163.com

湖北省疾病預防控制中心，武漢 430079

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0320-05

2014-05-18；

2015-01-07

國家科技重大專項課題(No.2012ZX10004207)

Supported by the Project of Pathogen Spectrum Research of Infectious Disease in Hubei Province (No. 2012ZX10004207-002)