利用多重聚合酶鏈反應和多色毛細管電泳分析布氏菌多位點可變數目串聯重復序列

姜 海，榮 蓉，田國忠，趙 娜，趙鴻雁，樸東日，趙赤鴻，崔步云

利用多重聚合酶鏈反應和多色毛細管電泳分析布氏菌多位點可變數目串聯重復序列

姜 海1，榮 蓉2，田國忠1，趙 娜1，趙鴻雁1，樸東日1，趙赤鴻2，崔步云1

目的 傳統的布魯氏菌多點可變數目串聯重復序列分析方法涉及16個位點(MLVA-16)，包括單重聚合酶鏈反應和瓊脂糖凝膠電泳，一直以來都作為標準的基因分型方法，用于布病的病原監測和流行病學調查。然而，目前這種傳統方法工作量較大，實驗室間結果不宜比較；尤其是對大規模菌株進行基因分型或面臨突發疫情時，急需一種高通量且快速的方法。方法 用多重PCR和多色毛細管電泳方法建立一種可靠的，高通量的且自動化程度較高的MLVA-16改良分型系統，用82株菌進行測試。結果 這種改良的MLVA-16分型系統具有很高的準確性，且具有快速和高通量的特點。結論 改良的MLVA-16分型系統可用于基層布病實驗室，為布病的病原監測提供高效的工具。

多重PCR； 多色毛細管電泳； 布魯氏菌； 基因分型

布氏菌病(布病)是由布氏菌屬細菌侵人機體后引起傳染—變態反應性人獸共患的傳染病[1-2]。人類及家畜、動物普遍易感，患者很容易轉為難以治愈的慢性病人；動物造成流產和不孕。布病遍布在世界上160多個國家，隨著全球化的影響，布病疫情發生了很多變化。一些國家布病再次出現，一些國家疫情愈演愈烈，尤其在地中海、中東、西亞、非洲和南美洲。中國每個省(市)區的人畜中幾乎都有不同程度布病的存在和流行[3]。布病是《中華人民共和國傳染病防治法》37種傳染病中的乙類傳染病。自建國以來，中國經歷了對布病疫情調查、流行病學規律的探索和分析、全面開展了預防和控制措施以及重點專項問題研究。在許多方面取得了顯著成績和進展。但是鑒于布病發病特點，近15年疫情呈持續增長態勢，愈演愈烈。目前，布病在中國已經是嚴重的公共衛生問題之一，預防和控制人畜布病成為一項迫在眉睫的重要工作。

確認布氏菌種(型)對于疫情判斷及流行病學溯源分析極為重要。因此，開展布病爆發流行的追蹤、溯源是布病預防控制技術支撐體系中亟須解決的問題。根據宿主偏好、致病力及流行病學特性，目前布氏菌屬已擴展為10個種[4-5]。分別是羊種(共3個型)、牛種(共8個型)、豬種(共5個型)、綿羊附睪種、犬種、沙林鼠種、2種新的海洋哺乳動物種(鯨、鰭)、田鼠種和Brucellainopinata種。傳統的生物型鑒定只能鑒定到種(型)，無法對菌株進行溯源分析。一些低分辨率的分子分型方法，如PCR產物限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)[6]、腸桿菌基因問重復序列(ERIC-PCR)[7]、基因外重復回文序列(REP-PCR)[8]隨機擴增多態性DNA(RAPD-PCR)[9]和擴增片段長度多態性分析(AFLP)[10]在分子流行病學中應用價值又十分局限。由于布氏菌屬種間DNA同源性高達90%，亟須一種高分辨力的分型方法用來提供疾病傳播模式和分子流行病學信息。多位點序列分析[11]和脈沖場凝膠電泳(PFGE)[12]應運而生，然而這些方法都存在有限的菌株間區分能力，無法對某一疫區間進行菌株流行病學關聯追蹤調查。多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)[13]是一個基于PCR技術的分型方法。該方法通過區分基因組上多個具有多態性串聯重復序列位點(VNTR)的重復數來區分菌株。串聯重復數不同的核酸片段經位于串聯重復的兩端引物擴增，通過瓊脂糖電泳、測序或毛細管電泳確定擴增產物大小，進而確定串聯重復數。此方法分辨率高、重復性好、快速、簡便，可用于流行病學溯源分析。

MLVA數據可以通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳很容易地產生， 但實驗室之間的比較仍然是個問題，因為瓊脂糖凝膠電泳無法解決某些特定位點模棱兩可的片段大小；而且這種方法工作量較大，尤其是對大規模菌株進行基因分型或面臨突發疫情時，急需一種高通量且快速的方法。在這篇研究中，我們利用多重PCR和多色毛細管電泳方法建立一種可靠的，自動化程度高且高通量的MLVA-16改良分型方法。本研究對4株標準菌株、34株流行羊種菌、17株流行牛種菌、18株流行豬種菌和9株流行犬種菌株進行改良的MLVA分析，驗證了該方法的可靠性和準確性，為布病的病原監測提供了強有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 布氏菌菌株 本實驗選用的標準菌株(16M、544A、1330S和RM6/66)及地方菌株(23株羊種3型、5株牛種1型、12株牛種3型、12株豬種1型、7株豬種3型和9株犬種菌)均來自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布魯氏菌病室。

1.2 細菌培養與基因組DNA的提取 將凍干菌株在布魯桿菌瓊脂斜面上復蘇后，參照標準菌株做硫堇、復紅染料抑菌實驗和噬菌體裂解實驗。用熱滅活的方式滅活細菌，然后用基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。基因組的提取按試劑盒說明書進行。提取的基因組DNA于-20℃保存備用。

1.3 16個位點多重PCR和多色毛細管分析方法 所用引物序列參照參考文獻，多重PCR組合及多色毛細管分析信息見表2。引物由北京擎科新業生物公司合成，并分別在各上游引物5′端標記熒光報告基團。見表1。

1.3.1 目的VNTR 位點擴增 采用多重聚合酶鏈反應技術( PCR) 擴增各VNTR 位點。1)反應體系:4套多重PCR均采用30 μL反應體系，包括2×EasyTaqPCR Super Mix:15 μL，4對混合引物(10 μm)2 μL，DNA模板(100 ng)2 μL，12 μL去離子水。 2)擴增條件: 預變性96 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 90 s、72 ℃30 s， 35個循環，最后72 ℃延伸5 min。每次擴增均以16M作陽性對照。

1.3.2 擴增結果檢測與分析 PCR 產物送北京擎科新業生物技術有限公司，采用ABI 3730XL 測序儀進行毛細管電泳; 根據GeneScan 1200 LIZ DNA Marker確定擴增產物大小，采用Gene-Mapper 4.0軟件進行分析并計算檢測位點中各VNTR 的重復次數。

2 結 果

2.1 4株標準株16個VNTR位點毛細管電泳觀察值與測序預期值比較 毛細管電泳分析VNTR片段的大小具有可重復性，每個位點的等位基因長度大小通過對其進行直接測序來驗證(表2)。通過毛細管電泳分析獲得的VNTR片段的大小，與預期的片段大小具有較低的標準差， 無需修改相應的等位基因串聯重復數目。

2.2 部分菌株部分VNTR位點多重PCR擴增后毛細管電泳檢測結果 菌株2011030多重PCR3bruce18(藍色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產物大小分別為136 bp、460 bp、229 bp和345 bp。菌株2011032多重PCR1bruce18(藍色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產物大小分別為124 bp、320 bp、363 bp和150 bp。菌株2010028多重PCR4 bruce18(藍色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產物大小分別為150 bp、246 bp、122 bp和185 bp。菌株2010022多重PCR2 bruce18(藍色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產物大小分別為177 bp、289 bp、310 bp和39 1bp。毛細管電泳檢測峰圖分別見圖1、圖2、圖3和圖4。根據標準菌株結果，證實了待檢菌株VNTR重復數的準確性。

2.3 16個位點不同等位基因擴增后毛細管電泳分析的測量誤差 16個位點不同等位基因擴增后毛細管電泳分析的測量誤差見表4，標準差范圍在0.03～0.23之間，證實了該方法的準確性。

表3 16個位點不同等位基因擴增后毛細管電泳分析的測量誤差

Tab.3 Variability in VNTR fragment measurements

3 討 論

MLVA方法是一種以PCR技術為基礎的方法，其操作簡單、分辨率高、結果分析容易、具有很高的重復性、并能夠提供數字化的分型信息，適宜進行大量樣本和網絡化分析。更重要的是，根據基因型特征型別的簇，提出預警信息，進而結合流行病學調查發現暴發關聯。尤其是發現散在分布于不同地理區域的暴發關聯，查找危險因素，明確傳播途徑，追溯傳染來源，為布病跨地區傳播菌株溯源和疾病控制提供可靠技術支撐。MLVA在揭示菌株間遺傳關系及流行病溯源調查中的意義在我們發表的多篇文章中已有闡述[14-16]，本研究已不再贅述，在此僅對方法學進行評述。

MLVA分析已經成功地在許多細菌中廣泛應用，包括所有涉及生物恐怖的致病菌如炭疽桿菌[17]和鼠疫耶爾森菌[18]。對于這些病原體，通過毛細管電泳估計VNTR片段大小是公認的金標準。對于布魯氏菌，瓊脂糖電泳估計VNTR片段大小是最廣泛使用的MLVA分析方法。該傳統方法便宜但相對耗時，不適于在疫情嚴重的省份進行大規模菌株基因分型。在這樣的背景下，采用新的高通量MLVA分型系統迫在眉睫。此外，這將允許實驗室繼續使用傳統的MLVA-16分型方案，并及時拓展了當前國際數據庫的疫情數據。本研究中的數據也可以用于其他實驗室菌株MLVA數據的參考，從而提高了分析的重現性。另外，預期值與觀察值之間存在很小的差異，不同菌株相同位點相同等位基因存在很小的標準差(表3)都證實了改良后該方法的準確性。當有新的疫情出現時，甚至涉及潛在的生物恐怖重大事件時，用改良的MLVA分型系統將成為應對這些事件的強有力工具。

隨著我國人間和畜問布病疫情持續快速上升。建立適于省級疾病預防控制(地方病)中心標準化的分子分型技術進行布氏菌分子流行病學研究，闡明布氏菌疫區基因型特征并揭示其流行病學相關性已迫在眉睫。布氏菌分子分型監測是未來我國布病實驗室常規監測的發展方向，是我國布病預防控制的關鍵支撐技術，也是我國公共衛生應急體系的重要組成部分，為提高和擴展布病防控能力提供新模式。布魯氏菌也可以被恐怖分子用來發動生物恐怖襲擊，因此生物反恐和防恐是保障我國安全的重要措施之一。為了快速、有效、經濟地預防和控制布魯氏菌的大面積暴發和流行，建立有效的病原微生物調查及溯源研究方法及深入了解布魯氏菌致病相關機制具有重要的作用。鑒于MLVA技術基于PulseNet標準化方案，可以作為細菌分子分型、基因組進化、分子流行病學研究、實驗室網絡監測以及相關科研的有力工具，改良的MLVA分型系統可以作為布魯氏菌流行病學調查中最重要的手段之一。

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MLVA-16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis

JIANG Hai1,RONG Rong2,TIAN Guo-zhong1,ZHAO Na1,ZHAO Hong-yan1,PIAO Dong-ri1,ZHAO Chi-hong2,CUI Bu-yun1

(1. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China；2. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

The Multi Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis 16 loci panel (MLVA-16), involving singleplex PCRs and agarose gel electrophoresis, is the standard genotyping method forBrucellaspp. used also for theBrucellainternational online database. To find a rapid and through-put genotyping method, modified MLVA-16 can be used. We described an alternative, reliable, high-throughput MLVA-16 protocol using multiplex PCRs and multicolor capillary electrophoresis. Furthermore, 82Brucellastrains were tested. Results showed that the modified MLVA-16 has proved to be accurate, rapid and throughput. It's indicated that the modified MLVA-16 is highly discriminatory and epidemiological concordance and is easy for brucellosis surveillance in province-level laboratory.

multiplex PCR; multicolor capillary electrophoresis;Brucella; genotyping

CUI Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn; ZHAO Chi-hong, Email: zhaoch@chinacdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.003

國家自然科學基金 (No.81271900)；國家衛生計生委公益性行業科研專項(No. 201302006)；重大專項(No. 2012ZX10004215)

崔步云，Email：cuibuyun@icdc.cn； 趙赤鴻，Email：zhaoch@chinacdc.cn

1.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,傳染病預防控制圍家重點實驗室,感染性疾 病協同診治協同創新中心，北京 102206 ； 2.中國疾病預防控制中心，北京 102206

R378.5

A

1002-2694(2015)04-0303-08

2014-10-13；

2014-12-06

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No.81271900)；the Special Scientific Research Fund of Public Welfare Profession of China (No. 201302006)；the Major Specil Fund(No. 2012ZX10004215)