豬附紅細胞體病的診斷技術綜述

文│牛藝儒 杜娟 左光大 史貴麗（山西省長治市畜牧獸醫局）

附紅細胞體病（eperythrozoonosis，簡稱附紅體病）是由附紅細胞體（Eperythrozoon，簡稱附紅體）引起的一種人畜共患傳染病，以貧血、黃疸、發熱為特征。該病最早發現于20世紀20年代，直到1950年確定豬的黃疸性貧血是由附紅體引起的，這樣才逐漸被人們重視起來。研究表明，目前，該病已廣泛分布于世界許多國家和地區，在對人類造成一定影響的同時，也給畜牧業生產帶來了經濟損失。

一、病原特性

由于附紅體在多種動物身上均可見，在不同動物中寄生的各有其名，寄生在豬身上的稱為豬附紅體（E.suis）和小附紅體（E.parvum）。光鏡下，豬附紅細胞體呈環形、球形、卵圓形以及桿狀等多種形態，它們多在紅細胞表面成團或單獨寄生，也有的在血漿中呈游離狀態，被附紅體寄生后的紅細胞呈多種形態。

附紅體對苯胺色素易著色，革蘭氏染色陰性，姬姆薩染色呈紫紅色，瑞氏染色呈淡藍色。Gulland等用掃描及透射電子顯微鏡，觀察到有豬附紅細胞體感染的病豬，附紅細胞體寄生的紅細胞呈凹陷球狀或短桿狀。

附紅體對干燥和化學藥物比較敏感，0.5%苯酚37℃經過3小時即可殺死，一般常用的消毒劑在幾分鐘內即可致其死亡。但它對低溫冷凍的抵抗力較強，可在低溫下存活數年之久。

附紅體是條件性致病菌，有特異性，在機體抵抗力低下或處于某些應激狀態時，豬附紅體感染率上升，甚至引起發病。

二、臨床癥狀

該病常感染率極高，豬附紅體寄生于紅細胞或者游離于血漿中，任何年齡段的豬均可發病，并且容易與其他疾病混合感染，多數情況下呈隱性經過。急性黃疸、高熱、貧血為該病的主要臨床特征，潛伏期不定，平均為7天左右。

不同階段的豬感染附紅細胞體后主要臨床癥狀如下：新生仔豬和斷奶仔豬的發病率和死亡率都比較高，早期癥狀為發熱，體溫高達40℃以上，皮膚發紅，食欲不振或者廢絕，精神沉郁，貧血、虛弱，康復后的仔豬常生長發育停滯。育肥豬生長緩慢，嚴重消瘦，抵抗力下降，容易感染其他疾病。母豬發病后繁殖障礙，生殖能力下降，出現不發情、受胎率降低、流產和死胎等癥狀。慢性感染的豬極度消瘦，皮膚蒼白，呼吸困難，生長緩慢，接近停滯。血液學檢查可見紅細胞數減少，血紅素下降，血漿白蛋白、β球蛋白、γ球蛋白均下降，淋巴細胞及單核細胞上升等。病程長短不一，短者幾天，長者數月，甚至數年，嚴重者死亡。

三、診斷研究

根據臨床表現可做出初步判斷，確診需做進一步實驗室檢查。

1.直接鏡檢。這種方法仍是診斷該病的主要手段。采集病豬的靜脈抗凝血，滴1滴于載玻片上，加入等量生理鹽水進行稀釋，混勻后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察其形態，患病的可見紅細胞形態結構改變，邊緣不整齊呈多種形態。附紅體聚集于紅細胞表面，數量不等，運動狀態也不同，形態常呈桿狀、環形、球形、逗點形、卵圓形、不規則形狀等。

由于附紅體對苯胺易于著色，因此可以用不同染液進行染色后觀察判斷。

2.電鏡觀察。在掃描電鏡下，可見附紅體呈大小不等的球形、卵圓形、桿狀等多形態，附有附紅細胞體的紅細胞呈星芒狀或不規則的多邊形，紅細胞膜產生凹陷、變形。在透射電鏡下，附紅體大小不等，呈多球性小體，并且可見細長狀的纖毛，無細胞壁、細胞器和細胞核，僅有單層限制膜包裹。該病不同的感染形式或處于不同階段的發病過程，其形態也可能不相同。

婁紅軍等在4580倍掃描電鏡下，在紅細胞表面可觀察到有大小不一鏈球狀、桿狀附紅細胞體附著，紅細胞呈波浪形。在透射電鏡12000倍下觀察，附紅細胞體為一近似球形結構物，邊緣密度較中間密度大，附著點有纖絲狀物與紅細胞相連。

3.補體結合試驗（CFT）。該方法是在1958年由Splitter首次用于對豬附紅細胞體病的診斷，這種方法對于診斷急性病例效果較好。在臨床上，發病后的第三天，血清檢查呈陽性，2～3周后逐漸轉為陰性，對于慢性帶菌豬一般呈陰性反應。Schuller W.等運用CFT對人工感染附紅細胞體病的豬血液中的抗體滴度進行了檢測，試驗結果發現抗體滴度變異較大，因此，該方法只適合于對豬群的檢測，而對少量的豬的檢測效果并不理想，即此方法不適用于對個體進行診斷。

4.間接血凝試驗（IHA）。Smith等于1975年首次建立了用間接血凝試驗檢測豬附紅細胞體的抗體，并把抗體滴度為1∶40作為該病為陽性的標準，這種方法靈敏度高，可檢測出CFT反應轉為陰性的耐過豬。張守發等采用不同動物的紅細胞經醛化、鞣酸化后致敏，也取得了較好的效果。目前，應用IHA研究人工感染豬附紅細胞體病是一種常用的血清學檢測方法，這種方法在一定程度上可以檢測出潛在感染的病豬。

5.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。1996年Lang等人用除去紅細胞的綿羊附紅細胞體抗原對羊進行ELISA檢測，并認為這種方法比IHA的敏感性高8倍。他們認為用這種方法檢測豬附紅細胞體的敏感性要高于IHA法，并且特異性較好，不與豬和牛的其他疾病發生交叉反應，然而這種方法不適合用于對小豬及公豬的診斷，也不適用于該病急性期的診斷。Hoelzle L.E.等對豬附紅細胞體的血清學診斷方法進行了改進，用間接ELISA和免疫雜交試驗法進行診斷，檢出率為100%。

6.間接熒光抗體試驗（IFAT）。這種方法最早用于診斷牛附紅細胞體病，在接種的第四天抗體首次出現，之后，隨著病原的增多，到第二十八天時達到高峰，而這種方法也比血液涂片法敏感很多。韓一超等采用這種方法，對部分規模化豬場和養豬戶的豬進行了流行病學調查和診斷，通過試驗發現，在隱性感染的豬群中，IFAT方法診斷的陽性率比直接鏡檢的高出11.2個百分點，并且差異顯著。因而，這種方法也可以用于對豬附紅細胞體病的診斷檢查。

7.分子生物學技術。隨著分子生物學技術在各個領域的廣泛運用，自上世紀末開始，國內外有大量關于動物附紅細胞體分子診斷方法的報道，主要有以下幾種：

（1）聚合酶鏈式反應（PCR）。PCR特點是可將單拷貝的靶序列放大百萬倍，該方法的優點就是靈敏性高。在臨床上，既可以檢測出急性感染的病例，同樣也可檢測出隱性感染的，并且檢測快速、特異性好，因此，這是一種敏感、有效的豬附紅細胞體病原確診方法，主要用于種原鑒定。

Gwaltney S.M.等首次使用PCR方法檢測純化的豬附紅細胞體感染的豬的組織和血液，擴增結果表明這種方法敏感性更高，更加快速，特異性也更強，并且這種方法同樣適用于診斷血液中少量附紅細胞體的慢性感染的病豬。Hoelzle L.E.等將純化后的豬附紅細胞體基因組酶切后獲得一段短片段，根據該片段設計引物建立PCR方法，對有明顯臨床癥狀的豬和處于潛伏期的豬進行檢測，結果表明該方法是檢測陰性感染附紅細胞體動物的一種好方法。

國內研究者使用此方法對該病的研究起步較晚，但發展迅速，相繼建立了各種動物的附紅細胞體病的PCR檢測方法。結果表明該方法敏感性高、特異性好、快速、準確，可以對豬附紅細胞體病進行病原學診斷和研究。

（2）熒光定量PCR方法（FQPCR）。閆若潛等經過條件優化，成功建立了豬附紅細胞體的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，比較發現該方法比普通PCR靈敏度高100倍，并且特異性也高，重復性好，準確率也高，較普通方法檢出的陽性率也高。朱紹輝等在國內首次建立了SYBR GreenI實時熒光定量PCR方法檢測豬附紅細胞體，結果表明該方法有較好的特異性、敏感性和廣譜性，從而為豬附紅細胞體病的臨床診斷檢測提供了新的技術手段。

（3）DNA探針技術。該方法的優勢在于特異性強，而缺點是敏感性較低，尤其是在輕度感染時檢出率很低，基本上等同于鏡檢的水平。Oberst R.D.等從基因文庫中克隆出一段序列KSU-2作為探針，可用于鑒別診斷感染豬與隱性感染豬血樣。另外，該探針與犬、馬、牛、貓等血樣DNA之間不發生雜交，但這種方法敏感性較低，不適合于豬附紅細胞體病的早期診斷。

四、展望

從20世紀中期豬附紅細胞體病發現至今，該病已成為一種日益嚴重的人畜共患病。近年來，我國部分地區開始發生此病，并造成了嚴重的經濟損失，從而使人們開始對此病加強了關注。

目前，國內外對于該病的研究還不是很深入，尤其是國內，雖然許多研究者已經建立了許多免疫學和分子生物學的診斷方法，且這些方法也比常規方法特異性好，敏感、高效，但也存在諸多不便于操作、試劑昂貴、無統一判斷標準等亟待解決的問題，對于國內不同地區的流行情況沒有很好的掌握，因此，隨著對附紅細胞體病研究的深入，有必要首先對國內不同地區的流行情況了解，逐步建立實驗室動物模型，運用先進的分子生物學技術，進而開發用于治療該病的疫苗，相信在不久的將來很有可能有效控制附紅細胞體病的發生和傳播，從而促進畜牧業的發展。