深圳市福田區新生兒聽力及耳聾基因聯合篩查分析

孫曉勉，陸 洋，黃旭麗

(1.深圳市福田區婦幼保健院兒保科，廣東 深圳 518000：2.南華大學研究生院，湖南 衡陽 421000)

深圳市福田區新生兒聽力及耳聾基因聯合篩查分析

孫曉勉1，陸 洋2，黃旭麗1

(1.深圳市福田區婦幼保健院兒保科，廣東 深圳 518000：2.南華大學研究生院，湖南 衡陽 421000)

目的 采用物理測聽和飛行時間質譜檢測技術對福田區所屬4家醫院產科出生的所有新生兒進行聽力及耳聾基因聯合篩查，階段性分析在深圳市新生兒中普遍進行聽力和耳聾基因聯合檢測的臨床應用價值。方法 在深圳市福田轄區4家醫院產科中，經新生兒監護人的知情同意，采集2014年7月至12月出生的新生兒足底血4 972份，提取全基因組DNA，用飛行時間質譜檢測技術檢測中國人群中常見的4個耳聾相關基因的20個突變位點，包括GJB2基因(35delG、167delT、176-191dell6、235delC、299-300delAT)，GJB3(538CA>T、547G>A)，SLC26A4(281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVSl5+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G)，線粒體12SrRNA(1494C>T、1555A>G)。同時進行聽力篩查，聽力初篩采用耳聲發射(OAE)，復篩用OAE結合聽性腦干反應(ABR)。結果 4 972例中聽力初篩未通過199例，占總數的4%，復篩時未通過13例，占0.3%；4 972例新生兒檢測出GJB2基因c.235delC、c.176del16和c.299-300delAT，35delG四種突變共90例；SLC26A4基因1174A>T、1226G>A、2168A>G、IVS7-2A>G突變74例；GJB3基因突變17例；線粒體12SrRNA基因m.1555A>G突變16例，線粒體12SrRNA基因m.1494C>T突變1例。GJB2基因299-300delAT、SCL26A4基因IVS7-2AG復合雜合突變，GJB2基因235del、12SrRNA1555AG復合雜合突變、GJB3基因538CT、SLC26A4基因IVS7-2AG復合雜合突變分別各1例。結論 福田區沒有耳聾家族史的新生兒中，GJB2基因的雜合突變率高于SLC26A4基因突變率，GJB3基因和線粒體12SrRNA基因突變較為少見，遺傳性耳聾基因檢測技術在新生兒篩查中具有很重要的臨床應用價值，對新生聾兒的早期發現和早期治療具有較重要的作用。

新生兒；聽力篩查；耳聾基因；聯合篩查

聾病是人類最常見的感覺功能障礙，是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，也是臨床常見的遺傳病之一[1]。2006年中國第2次殘疾人抽樣調查顯示，現有聽力殘疾者達2 780萬人，位居各類殘疾性疾病之首(占28%)，其中7歲以下的聾兒達80萬人，并以每年新增3萬聾兒的速度在增長。據統計，每1 000名新生兒中，就有1～3例聽力障礙兒童，其中至少一半與遺傳因素有關[2]。

遺傳性耳聾分為非綜合征型和綜合征型兩種類型，我國人群的大規模耳聾分子流行病學研究表明，大部分的非綜合征型耳聾由幾個基因的突變引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)和線粒體DNA 12SrRNA基因[3]。

本研究采用快速、高通量的飛行時間質譜檢測技術對4 972例新生兒進行4個耳聾相關基因的20個常見的突變位點篩查，以實現對聾兒的早期發現和早期治療，降低新生兒聾病的發生率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年7月至12月在福田區4家醫院產科出生，Apgar評分8～10分，無產科合并癥，母嬰同室的全部符合條件的新生兒4 972例為研究對象。孕周37～40周，體重2 350～3 760g，孕母妊娠期有特殊用藥及聽力損害家族史除外。其中男2 913例，女2 059例，男女比例1.41:1，均為漢族。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法

聽力初篩采用畸變產物耳聲發射(OAE)，復篩采用OAE結合聽性腦干誘發電位(ABR)。初篩時間為出生后3～5天，復篩為出生后42天，復篩未通過的患兒于生后3個月時行聽力學評估和診斷。

1.2.2 聽力診斷方法

根據患兒具體情況，采用聽性腦干反應、聽性穩態反應、聲導抗等，部分行顳骨CT掃描或核磁共振檢查。

1.2.3 聾病易感基因篩查方法

1.2.3.1 標本采集 經新生兒監護人書面知情同意后，由經過培訓的護理人員采集新生兒足跟血，置于采血濾紙片上，晾干后0～8℃保存備用。

1.2.3.2 基因檢測 抽提基因組DNA的血樣，送到華大基因實驗室，利用基質輔助激光解吸附/電離飛行時間(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOFMS)技術對耳聾基因進行檢測[4]。MALDI-TOFMS技術的主要特點是，將制備的樣本分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，而后用瞬時納秒(10～9s)強激光激發，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。即行耳聾易感基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、線粒體12SrRNA基因的20個位點檢測。

1.3 隨訪

對于聽力篩查和基因篩查結果異常者定期對其聽力情況、語言發育情況、干預情況等進行隨訪并給預防聾指導。

2 結果

2.1 聽力篩查結果

4 972例新生兒中，初篩耳聲發射檢測通過4 773例，未通過199例，初篩未通過率4.06%，3 025例同時接受了聽性腦干復測，未通過13例。

2.2 聾病易感基因的檢測結果

4 972例新生兒中進行了聾病易感基因的篩查，結果異常的有201例，總體陽性率為4.05%，各基因組檢出率進行卡方檢驗，χ2=1.525，P=0.000<0.001,差異有統計學意義，說明4個基因的檢出率之間有差別。異常基因分布情況見表1。其中199例聽力初篩未通過的新生兒中，聾病易感基因的篩查結果異常的有99例，耳聾基因總陽性率為49.7%(99/199)、致病突變率10.1%(20/199)、雜合攜帶率61.3%(122/199)，4 773例聽力初篩通過新生兒中聾病易感基因的篩查，結果異常的有102例，耳聾基因總陽性率2.13%(102/4 773)，致病突變率0.29%(14/4 773)，雜合攜帶率1.66%(79/4 773)。

從4個基因各位點的比較得出本人群的突變形式有GJB2基因有235delCA、299-300delAT、176-191del16、35delG突變，SLC26A4位點有IVS7-2AG、1174AT、2168ACT、1226GT突變，12SrRNA的位點有1494CT純合突變、1555AG純合突變，GJB3基因有538CT和547GA位點雜合突變。總致病突變攜帶率為4.05%，從高到低的排位是GJB2235delCA(1.37%)、SLC26A4IVS7-2AG(0.95%)、12SrRNA1555AG(0.32%)、GJB3538CT(0.18%)、547GA(0.16%)。

(轉下表)

(續上表)

2.3 聾病易感基因突變與性別的關系

2 913例男性新生兒中出現耳聾易感基因突變123例，突變攜帶率4.22%，2 059例女性新生兒中出現耳聾易感基因突變78例，突變攜帶率為3.79%，比較男女兩組間聾病易感基因突變攜帶率，差異無統計學意義(χ2=0.586，P=0.444>0.05)。

2.4 聾病基因突變與孕母年齡的關系

將孕母按照妊娠年齡分為20～<25歲；25～<30歲；30～<35歲；35～<40歲；40歲及以上4組，比較各組間新生嬰兒聾病易感基因突變攜帶率差異，結果顯示無統計學意義(χ2=4.252，P=0.373>0.05)，見表2。

表2 不同妊娠年齡孕母所生新生兒聾病易感基因突變攜帶率比較

Tabel 2 Comparison of susceptibility gene mutation carrier rate of deaf disease among newborns of women with different maternal gestational age

3 討論

3.1 新生兒聽力及耳聾基因聯合篩查的臨床意義

耳聾是臨床上最常見的遺傳病之一，有60%的耳聾是由遺傳缺陷引起的[5]，而且在大量的遲發性聽力下降患者中，亦有許多患者也是由于自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態性造成對致聾環境因素易感性增加而致病[6]。目前，我國各省市正在普及采用物理方法來進行新生兒聽力篩查，但隨著聽力篩查的逐漸普及，臨床也開始發現這一物理篩查方法的不足，如對遲發性耳聾和藥物性耳聾的漏檢，對先天性耳聾的確診需要經過多次隨訪，到2歲前后才能給出確切的結論，不能及早采取干預措施，錯過了孩子語言培訓的最佳時機，甚至導致由聾致啞。

王秋菊等于2007年提出，在新生兒聽力篩查中注入基因篩查的理念，實施新生兒的聽力及基因的同步篩查是目前作為早期發現處于語前聽力損失或遲發型高危患兒或者是致聾基因的攜帶者最為有力的篩查策略。

本次檢測耳聾基因總陽性率為4.05%，聽力初篩未通過新生兒耳聾基因總陽性率、致病突變率、雜合攜帶率均明顯高于聽力初篩通過新生兒，提示可將聽力初篩未通過新生兒作為目標人群進行常見耳聾基因篩查。但在本研究中，通過聽力篩查的新生兒中檢測到了致病突變201例，特別是有17例是藥物性耳聾相關基因和17例可能導致遲發性的，通過基因檢測，進行早期預警可避免藥物性耳聾發生，對遲發性聽力損失可進行早期干預。

3.2 異常耳聾基因攜帶者基因類型分布

我國聾病分子流行病學調查(2007年)顯示，21%的耳聾患者帶有GJB2基因突變，14.5%的患者帶有SLC26A4基因突變，3.8%和0.6%的患者分別帶有mtDNAA1555G和C1494T突變。

GJB2是引起非綜合性遺傳性耳聾最常見的聾病基因[7]，突變類型中主要235delC、299-300delAT、176-191del16[8]。本研究檢測結果中GJB2基因5個位點異常共有90例，占1.81%，攜帶率最高，突變也集中在235delC、299-300delAT、176-191del16這3個位點，還檢測到1例35delG突變，未檢測到167delT突變，檢測結果與文獻報道的相似。因GJB2基因相關耳聾患者的螺旋神經節細胞數量正常，適合人工耳蝸植入，該類患者在人工耳蝸植入后語言理解能力強，故明確GJB2基因突變致聾對治療和預后有重要意義。

Dai等(2009年)研究認為SLC26A4基因是僅次于GJB2突變而引起感音神經性聾的遺傳學病因，本研究中SLC26A4基因突變陽性率為1.49%，在4個基因中突變陽性率位于第2位，與文獻報道一致[9]。SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征有密切關系[10]，凡是引起顱內壓變化的因素如輕度的頭部碰撞、重度感冒等均能引起大前庭水管綜合征患兒的聽力下降及時檢測出SLC26A4基因突變可以指導患者在日常生活中避免激烈運動，顱腦外傷等環境因素導致遲發性的進行性聽力下降。及時發現病因，提示加強日常防護對避免或延緩患兒聽力損失甚為重要。

線粒體DNA 12SrRNA是最為常見的后天性氨基糖苷類藥物所致的藥物中毒性耳聾的原因之一[11]。A1555G突變在氨基糖苷類抗生素使用史聽力障礙患者中的發病率較高，氨基糖苷類抗生素使用史聽力障礙患者中可以發現13%～33%的患者有A1555G突變，本研究17名通過聽力篩查的新生兒中檢測到線粒體DNA 12SrRNA1555AG純合突變16例，1例DNA 12SrRNA1494CT純合突變，均為致病突變，雖全部通過了聽力篩查，但如果以后使用氨基糖苷類抗生素，可出現“一針致聾”的后果。告知家長檢測結果，提示對這17名嬰兒應高度預警，避免使用此類耳毒性藥物，基因檢測讓這些患兒終生受益。同時，由于線粒體DNA為母系遺傳，此基因檢測結果對家系中所有母系成員均可起到預警的作用。

GJB3基因是我國本土克隆和鑒定的第1個耳聾致病基因，可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征性耳聾，被認為與高頻聽力下降有關[12]。本研究共檢出17例GJB3雜合突變，該17例嬰兒42d時經DPOAE和ABR篩查均顯示通過，對這些嬰兒應定期進行聽力學監測，以早期發現聽力損失早期干預。

3.3 聾病易感基因與性別及母親生育年齡無關

本研究比較聾病易感基因攜帶的男女性別差異及孕母不同年齡生產的新生兒聾病易感基因攜帶狀況，均未顯示明顯差異，與有資料顯示聾病易感基因攜帶存在男性多于女性的差異不同。說明不同性別、區域及各個年齡段母親所生新生兒均有進行聾病易感基因篩查的必要性。

綜上所述，在現行聽力篩查基礎上聯合開展聾病易感基因普遍篩查，采用飛行時間質譜檢測技術對常見耳聾相關基因熱點突變檢出率較高、結果準確，具有快速、高通量、操作簡單等特點，能夠滿足臨床耳聾基因檢測的要求，應用于新生兒篩查，能夠有效檢出攜帶者及耳聾患兒，對遺傳性聾高危兒童及時進行聽力學監控和隨訪，對藥物中毒性耳聾高危兒童進行終生用藥指導、生活行為指導，進行人工耳蝸植入手術療效預測、遺傳咨詢和生育指導，對完善防聾治聾策略，降低遺傳性聾的發病率，致殘率意義重大。

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[3]Papacharalampous G X, Nikolopoulos T P, Davilis D I,etal.Universal newborn hearing screening, a revolutionary diagnosis of deafness:real benefits and limitations[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2011,268(10):1399-1406.

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[12]李紅娟,宋亞亮,劉黎明,等.語前聾患兒基因突變診斷的研究進展[J].中國婦幼健康研究,2008,19(6):587-588.

[專業責任編輯：劉黎明]

Hearing screening combined with deafness gene screening in newborns in Futian District

SUN Xiao-mian1, LU Yang2, HUANG Xu-li1

(1.DepartmentofChildHealth,ShenzhenMaternalandChildHealthCareHospital,GuangdongShenzhen518000,China; 2.UniversityofSouthChina,HunanHengyang421000,China)

Objective To perform hearing and deafness genes combined screening for all newborns born in four maternity hospitals in Futian District by using time of flight mass spectrometry (TOF-MS) detection and physical audiometry technology and to conduct periodic analysis of clinical applications of hearing and deafness genes combined detection in newborns in Shenzhen. Methods In four maternity hospitals in Futian District, 4 972 planta blood samples of newborns were collected during July to December in 2014 with guardian consent, and whole genomic DNA was extracted. TOF-MS was used to detect 20 mutation sites in four common deafness genes of Chinese population, including GJB2 gene (35delG, 167delT, 176-191dell6, 235delC, 299-300 delAT), GJB3 (538CA>T, 547G>A), SLC26A4 (281C T, 589G>A, IVS7-2A>G, 1174A >T, 1226G>A, 1229C>T, IVSl5+5G>A, 1975G>C, 2027T>A, 2162C>T, 2168A>G), mitochondria 12SrRNA (1494C>T, 1555A>G). At the same time hearing screening was performed with otoacoustic emission (OAE) and combining OAE with auditory brainstem response (ABR) for secondary screening. Results Of 4 972 patients 199 cases (4%) did not pass hearing screening and 13 cases (0.3%) did not pass secondary screening. Ninety cases were found with GJB2 gene c.235delC, c.176del16, c.299-300delAT and 35delG mutation, 74 cases were found with SLC26A4 gene 1174A>T, 1226G>A, 2168A>G, IVS7-2A>G mutation, 17 cases with GJB3 mutation, 16 cases with mitochondrial gene 12SrRNA m.1555A>G mutation, and one case with mitochondrial gene 12SrRNA m.1494C>T mutation. GJB2 gene 299-300delAT, SCL26A4 IVS7-2AG compound heterozygous mutation, GJB2 gene 235del, 12SrRNA1555AG compound heterozygous mutation, GJB3 gene 538CT, and SLC26A4 gene IVS7-2AG compound heterozygous mutation were found in 1 case, respectively. Conclusion Of the newborns without family history of deafness in Futian District, heterozygous mutation rate of GJB2 gene is higher than mutation rate of SLC26A4 gene, and gene mutations of GJB3 gene and 12SrRNA mitochondrial gene are rare. Genetic testing technology for hereditary deafness in newborn screening is very important in clinics, which is essential to early detection and early treatment of newborn deafness.

newborns; hearing screening; deafness gene; combined screening

2015-05-22

深圳市科創委知識創新計劃資助項目(項目編號：JCYJ20140415094713859)

孫曉勉(1961-)，女，主任醫師，主要從事兒童保健工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.004

R764.04

A

1673-5293(2015)06-1119-1121